張 潔

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030801）

總RNA提取技術(shù)是一項(xiàng)分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，目前已建立了許多RNA提取方法[1-3]。實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模提取總RNA最常用的是Chomezynski等[4-5]提出的異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，對大多數(shù)的動植物材料都能得到質(zhì)量很好的RNA樣品。但對富含多糖、糖蛋白等次生物質(zhì)的材料如大部分的真菌卻不適用，因?yàn)槔迷摲椒ㄌ崛〉恼婢鶵NA富含RNA酶，其會造成RNA的化學(xué)降解，會使多糖以及糖蛋白形成難溶的膠狀物，與RNA共沉淀下來[6]。

本研究對提取多糖、多酚的棉花RNA取得良好結(jié)果的CTAB酸酚法進(jìn)行了改進(jìn)，以棉花黃萎病菌株VD8的菌絲為材料，通過適當(dāng)增加變性劑的濃度，有效地抑制RNA酶活性，用LiCl選擇性沉淀RNA和醋酸鈉沉淀祛除多糖，旨在為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供便利。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

用保存在試管里的棉花黃萎病菌株VD8（由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳與種質(zhì)資源實(shí)驗(yàn)室惠贈）復(fù)壯于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，將PDA培養(yǎng)基的黃萎病病菌菌落接種到裝有已滅菌的100 mLCzapek’s液體培養(yǎng)基的250 mL平底燒杯中，25℃振蕩培養(yǎng)8～10 d。然后將黃萎病菌系培養(yǎng)物經(jīng)4層紗布過濾，用液氮速凍紗布上的菌絲，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 試劑

RNA 提取緩沖液：1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris·HCl（pH 值為 8.0），20 mmol/L EDTA，2%CTAB，2%PVP，2% β- 巰基乙醇；8 mol/LLiCl；異丙醇；70%乙醇；0.4 mol/L NaOH；3 mol/L NaAc（pH值為5.2）；Tris平衡酚；氯仿；氯仿∶異戊醇（體積比24∶1）溶液；DEPC處理過的水。

1.3 方法

器材處理。實(shí)驗(yàn)中所用的玻璃器皿與用具均需在240℃下烘烤4 h，塑料制品在37℃下0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水中浸泡12 h，然后經(jīng)高溫滅菌后方能使用。

（1）取1 g棉花黃萎病菌絲于研缽中，加液氮充分研磨成粉末狀，然后轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中；往離心管中加入5 mL的RNA提取緩沖液，振蕩混勻，65℃水浴約20 min，中途混合2～3次。（2）再加入0.6體積的氯仿，來回充分混勻，然后冰浴10 min；4℃，8 000 r/min離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一10 mL的新離心管中，再加入1/3體積的8 mol/L LiCl溶液，混合均勻，然后冰浴 4 h。（3）4℃，8 000 r/min離心 20 min，棄去上部溶液，沉淀用70%乙醇洗滌，將洗滌液轉(zhuǎn)移到一2 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min，吸去乙醇溶液，用真空泵將沉淀抽干，加2 mL的DEPC水溶解沉淀，加0.8體積的酸酚/氯仿溶液（體積比1∶1），充分混合均勻，然后室溫靜置5 min；4℃，12 000 r/min離心 20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一2 mL的新離心管中，再重復(fù)用酸酚/氯仿溶液抽提1次；上清液加0.8體積氯仿抽提1次，吸取上清液并加入1/10體積3 mol/L NaAc（pH值5.2）溶液和1體積預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置 2 h。（4）4 ℃，12 000 r/min 離心 20 min，收集RNA沉淀，用70%乙醇洗滌RNA沉淀2次，真空干燥后再加入100 μL的DEPC水，使之充分溶解，放于-80℃冰箱備用。

1.4 電泳檢測

電泳槽用0.4 mo1/LNaOH浸泡4 h以上，采用DEPC水配制的pH值為8.0的Tris-醋酸-EDTA電泳緩沖液TAE，用1%的非變性瓊脂糖凝膠檢測。取黃萎病菌絲RNA1 μL進(jìn)行電泳檢測。電壓120 V，電泳15 min。

1.5 核酸-蛋白分析儀測定

提取的RNA樣品取1 μL用backman DU 640 核酸 - 蛋白分析儀測定 OD230，OD260，OD280的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測

提取的棉花黃萎病菌絲RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，黃萎病菌絲RNA的28 S rRNA與18 S rRNA帶型整齊，基本不拖尾，而且28 S rRNA帶的亮度明顯高于18 S rRNA，說明RNA未發(fā)生降解，完整性較好（圖1）。有少量的DNA污染時，可以用不含RNA酶的DNA酶進(jìn)行降解處理[7]。

2.2 核酸-蛋白分析儀測定

提取的RNA樣品用backman DU640核酸-蛋白分析儀測定 OD230，OD260，OD280的吸光度，結(jié)果表明，OD280/OD260值界于 1.8～2.1之間，OD260/OD230值為2.54，說明RNA樣品中沒有蛋白質(zhì)和鹽的污染，質(zhì)量較好，完全可適合分子生物學(xué)進(jìn)一步研究。

3 討論

棉花黃萎病菌絲富含多糖和次生物質(zhì)，難于提取到高質(zhì)量的RNA。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌絲在取樣過程中容易受到外源RNA酶降解，樣品放長時間后提取質(zhì)量會下降，這是由于菌絲培養(yǎng)過程中并沒有RNA酶抑制劑，外源RNA酶較多，不能被消除，因此，建議樣品保存時間不要過長，以免影響到RNA的提取質(zhì)量。

本研究針對真菌菌絲次生物質(zhì)含量高的特點(diǎn)，對CTAB提取RNA法進(jìn)行改良。首先，將β-巰基乙醇的用量提高到2%，這樣在提取過程中可以有效地抑制內(nèi)源性RNA酶活性和防止酚類化合物的氧化。

研究者針對富含多糖植物組織的RNA提取，提出了利用LiCl選擇性沉淀RNA[8]和醋酸鈉沉淀多糖的改進(jìn)方法。通過2次酸性條件下的酚/氯仿抽提，有效地去除DNA和蛋白質(zhì)污染。用LiCl選擇性地沉淀RNA，可以除去大部分的DNA；在有鈉鹽的條件下，用異丙醇選擇性沉淀RNA，可以除去高含量的多糖。用LiCl選擇性沉淀RNA時，建議時間不要太長，過長則大量的多糖很容易包裹RNA沉淀下來[9]。杜中軍等[10]用LiCl沉淀提取芒果果肉組織RNA時，也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。研究者經(jīng)過幾次對比，4 h就能達(dá)到沉淀RNA的效果。此外，該方法對含有多酚的組織材料提取RNA也有很好的效果[11]。用改進(jìn)的CTAB酸酚法提取真菌菌絲RNA的方法操作簡單、迅速，在10 h之內(nèi)就能提取出RNA，其適用于含次生物質(zhì)豐富的真菌RNA提取。

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［6］Lewinsohn E.Simple isolation of functional RNA from woody stems ofgymnosperms[J].Plant BioReptr，1994，12：20-25.

［7］韓玉杰，賈煒瓏，王自霞，等.幾種提取植物DNA方法的比較[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（7）：17-19.

［8］De Vries S.Isolation of total and polysomal RNA from plant tissues[J].Plant Molecular BiologyManual，1993，36：1-13.

［9］方華舟.核糖核酸干擾（RNAi）研究進(jìn)展及其在植物學(xué)中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2007（5）：70-74.

［10］杜中軍，徐兵強(qiáng).一種改進(jìn)的富含多糖的芒果組織中完整總RNA提取方法[J].植物生理學(xué)通訊，2005（2）：202-204.

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