黃婷婷，王紅亮，唐剛華

（中山大學附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學PET－CT中心，廣東 廣州 510080）

細胞凋亡（apoptosis）是細胞生命的基本特征之一。對活體內細胞凋亡進行分子顯像對于疾病治療效果評估、治療進程的監(jiān)測、以及某些疾病的早期診斷或研究新療法具有非常重要意義。正電子發(fā)射斷層顯像（PET）作為近年來新興的無創(chuàng)性功能性顯像手段，是最前沿、最先進的分子影像學技術，研發(fā)細胞凋亡PET探針是實現(xiàn)活體內細胞凋亡PET顯像的前提條件。臨床上細胞凋亡顯像劑研究最初主要集中于大分子蛋白質探針，鑒于大分子蛋白質探針的局限性，研發(fā)細胞凋亡小分子PET探針具有非常重要的臨床價值。

1 細胞凋亡與PET分子顯像

1.1 細胞凋亡

最早在1972年，Kerr、Wyllie和 Currie等［1］3位科學家共同提出了“細胞凋亡（Apoptosis）”的概念。細胞凋亡和細胞壞死是細胞死亡的兩個主要形式，兩者的不同主要在于細胞形態(tài)學特征的變化，前者的典型形態(tài)學變化表現(xiàn)為凋亡早期細胞體縮小、胞漿量減少、核染色質濃縮、核仁裂解，繼之細胞膜內陷，胞體自行分割成許多由膜包裹的結構完整的超微細胞體（稱為凋亡小體，Apoptotic Body），最后凋亡小體被鄰近組織識別、吞噬或自行脫落，離開生物體，這是一種主動的、程序化的細胞死亡過程。而細胞壞死的細胞結構全面溶解、破壞，是無基因調控、不耗能的被動的細胞死亡過程。

細胞凋亡是多種基因調控的細胞程序化死亡過程，具有重要的生物學意義及復雜的分子生物學機制，可見于胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、組織分化、免疫調節(jié)等諸多生理過程和惡性腫瘤、心肌梗塞、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、艾滋病等多種病理情況［2］。細胞凋亡是有核細胞固有的生理過程，并受遺傳調控蛋白系統(tǒng)的嚴格制衡，無論生理性的或與疾病相關的細胞變化都可能觸發(fā)凋亡程序，最終導致細胞進入死亡過程。細胞凋亡的發(fā)生主要經過兩種途徑［3］：①內源性途徑，即線粒體途徑，線粒體通透性的改變，細胞膜不可逆性的去極化，細胞色素C的釋放，蛋白凋亡酶Caspase的激活；②外源性途徑，即死亡受體途徑，死亡受體及配體（如腫瘤壞死因子、介導凋亡配體相關的腫瘤壞死因子和Fas配體等）的跨膜和誘發(fā)Caspase激活信號的傳導。細胞凋亡程序通過內源或外源性途徑啟動之后，凋亡細胞自身會產生一系列的病理生理改變。在這一過程中凋亡細胞將產生（或暴露、結合）多種可識別的、特異性的化學信號（靶標），通過正電子核素標記配體與凋亡細胞中特異靶標結合的特性即可進行細胞凋亡PET分子顯像。

1.2 細胞凋亡PET顯像的優(yōu)勢

目前，已有多種實驗室技術（如形態(tài)學方法和細胞分子生物學方法等）用于檢測細胞凋亡，這些方法屬于體外研究方法，對活體器官、組織具有創(chuàng)傷性，且通常只能在某一特定時間點進行研究，不能連續(xù)、動態(tài)檢測和監(jiān)測細胞凋亡現(xiàn)象在活體內的發(fā)生、發(fā)展的全過程，同時受到多種因素的影響。利用無創(chuàng)傷性分子影像學技術，如光學成像、磁共振成像（MRI）、核醫(yī)學成像技術及超聲（US）成像等，用熒光素、順磁性物質、放射性核素及微泡等報告要素標記AnnexinⅤ作為顯像劑，檢測活體細胞凋亡，是很有前景的分子顯像方法。然而，MRI和US由于靈敏度較低，光學成像技術由于穿透力和斷層分辨率較低，其應用受到一定程度的限制。單光子發(fā)射計算機斷層成像（SPECT）由于具有較低分辨率，其應用也受到一定限制。PET技術在腫瘤學、神經精神病學和心臟病學中的應用價值已得到人們認可，并顯示出巨大應用前景。與其他分子影像學技術（如SPECT）相比，PET具有高靈敏度和合適的斷層分辨率、標記藥物半衰期短且不改變原藥物的藥理活性等顯著優(yōu)點，通過與X線計算機斷層（CT）顯像同機融合后，PET顯像更趨完善，無創(chuàng)傷性的PET顯像可望成為活體內檢測細胞凋亡的最佳技術。

1.3 細胞凋亡大分子PET探針的局限性

AnnexinⅤ是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能夠專一性地結合暴露在細胞膜外側的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidyl Serine，PS）。99Tcm標記的磷脂結合蛋白（99Tcm－Annexin Ⅴ）是第一個用于臨床的細胞凋亡放射性顯像劑，臨床研究［4］證實：99Tcm－AnnexinⅤ作為顯像劑在心血管疾病如心肌梗塞、粥樣硬化斑塊中的細胞凋亡檢測，多種腫瘤（如頭頸部腫瘤）的療效評價和預后判斷等方面具有一定優(yōu)勢。然而，由于AnnexinⅤ相對分子質量較大（3.6×104），導致血液清除較慢，信噪比（SNR）低，早期顯像效果不佳，以及制備成本高，結合特異性差和具有免疫原性等缺點［5］，阻礙了其在臨床上的廣泛應用。另外，正電 子 核 素 標 記 的 Annexin Ⅴ （18F－AnnexinⅤ）雖可改善其某些藥代動力學特性，但仍不能克服其大分子蛋白質的缺陷，且其放射性標記較復雜，在臨床上的應用并不理想［6，7］。其他半衰期較長的正電子核素（如64Cu［8］、124I［9］等）標記的AnnexinⅤ也有報道，但仍處于實驗研究階段，尚無臨床研究報道。

2 細胞凋亡小分子PET探針及其應用

理論上，與大分子蛋白質相比，相對分子質量小的化合物作為PET顯像劑更有優(yōu)勢［10］，主要表現(xiàn)在小分子PET探針放射性核素標記相對簡單易行，而且具有更合適的體內生物分布和清除率，不易引起免疫反應，同時可以通過結構修飾得到應用性能更優(yōu)化的PET分子探針。細胞凋亡過程中除了外翻PS作為AnnexinⅤ的作用靶點之外，其他的形態(tài)學變化或生物學變化都可以作為研究細胞凋亡的重要標志，例如活化的Caspase酶、線粒體膜電位耗散和細胞膜印跡等，并提供了更多可用于檢測細胞凋亡的作用靶點。目前研究比較多的細胞凋亡小分子PET顯像劑主要有：Caspase酶小分子抑制劑類探針、Aposense分子類探針、靶向線粒體膜電位下降的陽離子類探針［11］以及靶向PS小分子類探針，其各自的代表結構式示于圖1。

圖1 細胞凋亡小分子PET顯像劑的相關結構式

2.1 靶向Caspase PET顯像劑

細胞在實現(xiàn)凋亡的兩種途徑中最后都導致Caspase－3的活化，進而激活內切核酸酶，使DNA鏈斷裂，最終導致細胞結構的全面解體。因此，激活的Caspase酶可作為檢測細胞凋亡的一個重要靶點。研究初期主要集中在尋求基于多肽類的配體，后來發(fā)現(xiàn)靛紅磺胺基類的小分子化合物是一類有效的Caspase抑制劑。通過使用核素標記的Caspase小分子抑制劑靶向結合Caspase，活體內對凋亡細胞進行PET顯像，包括化 合 物18F－ICMT－11、18F－WC－Ⅱ－89、11C－WC－98 和18F－WC－Ⅳ－3［12－17］。 這 些 分 子 探 針 與Caspase－3具有較高的親和力，動物實驗表明，在環(huán)己酰亞胺或抗Fas抗體介導的肝細胞凋亡模型中肝部放射性攝取明顯增高，經過組織學檢查也進一步證實了肝細胞發(fā)生了凋亡。但是體內外的抑制性實驗［17］表明，在加入靛紅類化合物作為抑制劑后，放射性攝取未明顯降低，同時其生物分布特性較差，這些可能與靛紅類化合物的分子結構中含有聯(lián)二羰基的結構有關。盡管該結構是與Caspase中半胱氨酸的親核性巰基結合的必需基團，但是該結構也使其易與其他含有胺基和巰基基團的化合物結合，從而導致了該類化合物與其他半胱氨酸蛋白酶（如組織蛋白酶）物質的非特異結合。鑒于Caspases在細胞凋亡過程中的重要作用，用靶向結合激活的Caspase檢測細胞凋亡是一種很有效方法，通過進一步優(yōu)化其分子結構和改善其應用特性，很有可能進入到臨床研究。

2.2 線粒體膜去電勢化的PET顯像劑

近來研究表明，細胞凋亡發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)不在細胞核，而在細胞質。在凋亡細胞被誘導產生特征性形態(tài)改變和DNA降解之前，線粒體膜功能發(fā)生改變，內膜跨膜電位消失和線粒體內蛋白酶活化物的釋放，激發(fā)了各種與凋亡相關的代謝變化。因此，在細胞凋亡初期，細胞內線粒體膜電位下降是細胞凋亡發(fā)生的重要標志之一［18］。凋亡因子一旦從線粒體基質傳至細胞質后，細胞膜通透性增加，從而導致線粒體膜電位下降［19］。18F－氟苯三苯基磷陽離子（18F－FBnTP）是一種對電位敏感的陽離子PET探針，能夠感應到凋亡細胞內線粒體膜電位下降。在正常細胞內線粒體膜內的電化學質子梯度能夠促進該陽離子探針進入線粒體基質，而在細胞凋亡早期，該質子梯度消失，使得進入線粒體內的陽離子探針的量減少，造成攝取信號降低。在體外用星孢菌素處理過的肺癌細胞［20］、紫杉醇處理過的乳腺癌細胞［21］和在體內用多烯紫杉醇處理過的荷前列腺癌［22］小鼠模型實驗均證實，癌細胞攝取18F－FBnTP明顯減低。通過檢測線粒體膜電位勢能耗損的方法研究細胞凋亡具有一定的局限性。這是由于該方法不能區(qū)分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化，例如細胞內耐藥性蛋白質作用也會造成這類陽離子探針的外流，會使一些正常細胞誤判為凋亡細胞［20，21］，因而需要進一步優(yōu)化該類分子探針的性能。

2.3 靶向凋亡細胞膜印跡的PET顯像劑

凋亡細胞膜印跡是指發(fā)生于凋亡早期細胞的復雜改變。這種印跡包含了質膜勢能不可逆缺失、外質膜小葉和細胞液的永久酸化、以及細胞膜磷脂化爬行酶系統(tǒng)的活化，然而細胞膜完整性得以保存。針對此生物性能，研究人員已成功合成了一系列新穎的小分子探針Aposense化合物（如DDC、ML－10、ML－9、NST－732和 NST－729），用于探測與細胞凋亡相關的各種細胞變化，包括凋亡爬行酶的活化、細胞膜不可逆去極化和細胞內液的酸化等［23］。這些化合物已用于抗癌物質介 導凋亡的腫瘤模型［23－25］、腎衰 模型［26］和缺血性大腦卒中的神經血管凋亡［5］等顯像。Zeng等［27］通過使用18F 標記的 Aposense化合物NST－732，進一步證實了該類化合物能夠用于檢測化療誘導的細胞凋亡?？蓞^(qū)分凋亡和壞死細胞的18F標記烷基丙二酸衍生物（18FML－10）是Aposense家族中一種結構簡單的化合物（相對分子質量為206）［22］，可在凋亡細胞內選擇性濃聚，這與凋亡細胞中線粒體膜勢能的消失、Caspase激活、以及凋亡DNA片段化相關。Reshef等［28］利用18F－ML－10在腦中風的活體模型進行PET顯像，PET顯像清楚顯示了在缺血的腦半球攝取明顯增加，在對側則相反。18FML－10的生物分布顯示：示蹤劑集中在梗塞區(qū)域；感興趣區(qū)分析顯示，缺血區(qū)放射性濃聚程度是對側的6～10倍，而且18F－ML－10攝取與組織病理學具有很好的相關性。18F－ML－10是首個進入臨床階段探測細胞凋亡的PET小分子示蹤劑，目前在數個小規(guī)模的臨床試驗中都表現(xiàn)出較好的應用效果。在臨床Ⅰ期試驗［29］中，在健康志愿者體內18F－ML－10表現(xiàn)了的高穩(wěn)定性、適宜的生物分布和劑量濃度。

2.4 靶向PS小分子PET顯像劑

細胞凋亡早期，由于細胞內Ca2＋水平增加，使處于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸翻轉至細胞外側，外翻的PS是研究細胞凋亡重要的靶點之一［23，30］。目前一些靶向PS的小分子化合物逐漸被開發(fā)，其中最有應用前景的是二（2，2’－二吡啶甲基胺）－Zn2＋類配合物（bis（Zn2＋－2，2｀－dipicolylamine），Zn2＋－DPA），它屬于依賴 Zn2＋型小分 子 化 合 物［31，32］。 含 有 報 告 要 素 熒 光 素 的Zn2＋－DPA配位物已用于體外細胞凋亡實驗和體內 動 物 腫 瘤 的 光 學 顯 像 研 究［33，34］。Tang等［35］通過 N－烷基化反應，引入正電子核素18F標記的氟乙基，實現(xiàn)了Zn2＋－DPA配位物的放射性標記。另外，通過使用18F－SFB得到放化收率更高的18F標記的Zn2＋－DPA配位物，初步的動物實驗［35］表明：該類化合物較AnnexinⅤ具有更好的藥代動力學特征，荷瘤小鼠經過藥物治療后，18F－FB－DPAZn2＋在腫瘤部位放射性攝取明顯增加，且藥物治療前后，18F－FDG在腫瘤部位的放射性攝取沒有明顯變化。因此，正電子核素標記的Zn2＋－DPA類化合物，對于活體內顯像細胞凋亡和腫瘤藥物的療效評價具有一定的應用潛力。

3 結語與展望

綜上所述，從靶向PS的AnnexinⅤ為代表的蛋白類大分子探針，到探測細胞凋亡過程中多個級聯(lián)反應中的小分子探針，說明研發(fā)新的細胞凋亡小分子PET顯像劑將是細胞凋亡分子顯像領域重要的發(fā)展方向。小分子PET探針今后幾年的發(fā)展方向主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

1）靶向PS的小分子PET探針是研究的熱點之一，具有很大發(fā)展?jié)摿?，目前靶向PS的小分子PET探針除本研究團隊的報道外，尚未發(fā)現(xiàn)其他研究報道，靶向PS的小分子PET探針是細胞凋亡小分子PET顯像的重要發(fā)展方向。

2）能區(qū)分細胞凋亡和壞死的小分子PET顯像劑的研制，也是細胞凋亡研究的熱點領域。盡管目前已有可區(qū)分細胞凋亡和壞死的小分子PET顯像劑用于臨床的研究報道，但其在臨床中的實用性有待于進一步研究。

3）針對細胞凋亡過程中表達的其他靶點分子，研制新型細胞凋亡小分子PET顯像劑，也是細胞凋亡小分子PET顯像的重要發(fā)展方向。

此外，對于臨床上如何準確評價抗腫瘤藥物治療效果的問題，一直是抗腫瘤治療研究的熱點領域。傳統(tǒng)觀點認為細胞凋亡顯像能夠準確評價抗腫瘤治療效果，但是抗腫瘤治療在導致細胞凋亡的同時，也伴隨著細胞壞死［30］。判斷細胞凋亡和細胞死亡能更準確評價腫瘤治療效果，這是臨床上必須解決的難點問題。

總之，開發(fā)能最大限度涵蓋細胞凋亡途徑和非凋亡途徑的多個作用靶點的新型小分子細胞凋亡PET顯像劑是今后發(fā)展的重要方向。

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