張 姝，羅世能，邱 玲，林建國，夏詠梅

（1.江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江蘇省原子醫(yī)學研究所，衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗室，江蘇省分子核醫(yī)學重點實驗室，江蘇 無錫 214063）

自20世紀70年代初用99Tcm標記的親骨顯像劑問世以來，放射性核素骨顯像已被廣泛應(yīng)用，并成為核醫(yī)學科的一個重要分支［1］。目前臨床上使用的骨顯像劑主要是99Tcm標記的雙膦酸鹽類，其中以99Tcm－MDP 應(yīng)用最為廣泛［2］，它具有親骨特異性強、血液清除率快、骨顯影清晰、毒性低、不被肝臟攝取等優(yōu)點，但其在體內(nèi)代謝較慢，給藥后需要3～4h才能顯像［3］。

唑來膦酸是分子內(nèi)含有咪唑基的第3代雙膦酸鹽類藥物的代表，該藥主要用于治療腫瘤引起的高鈣血癥、骨轉(zhuǎn)移和老年骨質(zhì)疏松癥及預(yù)防骨轉(zhuǎn)移患者的并發(fā)癥，是目前臨床試驗中作用最強的雙膦酸鹽化合物［4］。用99Tcm標記唑來膦酸鹽類藥物進行骨顯像，1h后即可得到清晰的骨顯 像［5，6］，與99Tcm－MDP 相 比，99Tcm標 記 唑來膦酸鹽類藥物大大縮短了顯像等待時間。然而前期研究表明，該類顯像藥物雖然有較高的骨攝取，但在肝、脾、肺和腎的吸收均很高，且清除速率較慢，對人體健康不利［2］。近年來，本研究小組報道了用99Tcm標記唑來膦酸衍生物如MIDP［7］、EIDP［8］、PIDP［9］和i－PIDP［5］，并 探 索了其進行骨顯像的可能性。結(jié)果顯示，室溫下標記率均可達到90%以上；當咪唑環(huán)上的2位上引入烷基取代基時，其顯像效果明顯提高，肝、脾、肺的吸收明顯降低，只有腎的吸收較高，可以說明該藥物主要經(jīng)腎代謝，通過尿液排出體外，對人體其他組織傷害較小。

最近本研究小組制備出了一種新型的唑來膦酸衍生物：1－羥基－3－（2－丁基－1H －咪唑－1基）丙烷－1，1－雙膦酸（BIPrDP），它是在唑來膦酸的基礎(chǔ)上，對其結(jié)構(gòu)進一步優(yōu)化，在咪唑環(huán)的2位上引入丁基取代基，并將與雙膦酸基團相連碳的個數(shù)由2增加到了3。用Na99TcmO4對BIPrDP進行標記時，發(fā)現(xiàn)該化合物在室溫下標記率很低，不能滿足要求。為此，本課題組進一步研究了99Tcm－BIPrDP制備反應(yīng)動力學性質(zhì)。通過標記反應(yīng)動力學的研究，旨在揭示反應(yīng)溫度和時間對99Tcm－BIPrDP 制 備 的 影響，為99Tcm－BIPrDP的制備提供理論依據(jù)，也為該類99Tcm標唑來膦酸類放射性藥物今后在臨床上的推廣應(yīng)用提供重要的指導(dǎo)信息。

1 實驗材料

1.1 主要試劑

2－丁基咪唑：上海翰鴻化工科技有限公司；溴丙酸乙酯：上海邦成化工有限公司；Na99TcmO4淋洗液：江蘇省原子醫(yī)學研究所附屬江原醫(yī)院提供；氫氧化鉀、碳酸鉀、四丁基溴化胺、三氯化磷、磷酸、鹽酸、氯化亞錫均為中國醫(yī)藥集團上海試劑公司。

1.2 主要儀器

Yanadimoto型熔點儀：日本島津公司；WatersPlatform ZMD4000型質(zhì)譜儀：美國 Waters公司；Bruker AM400型核磁共振儀：Bruker光譜儀器公司；γ計數(shù)儀：Perkins Elmer儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 BIPrDP的合成

在參閱文獻［10－12］的基礎(chǔ)上，對唑來膦酸進行結(jié)構(gòu)改進，自行設(shè)計合成BIPrDP，具體合成線路示于圖1。采用 MS、1H－NMR和元素分析方法對目標物和中間體進行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.1.1 3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙酸乙酯（b）的合成 向250mL三口燒瓶中加入12.4g（0.1mol）2－丁基 咪 唑 （a）、13.8g（0.1mol）K2CO3、8.4g（0.15mol）KOH、0.8g（0.002 5mol）四 丁 基 溴 化 銨 和 100mL CH2Cl2，室溫下攪拌0.5h。用恒壓漏斗向燒瓶中緩慢滴加12.7mL（0.1mol）溴丙酸乙酯，在50℃油浴下反應(yīng)20h。過濾，濾餅用50mL CH2Cl2洗滌3次。濾液再用飽和NaCl溶液洗3次，取CH2Cl2層，減壓濃縮，除去CH2Cl2，得到紅褐色黏稠液體b，此物質(zhì)未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。

2.1.2 3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙酸（c）的合成 將上述紅褐色黏稠液體b加入250mL燒瓶中，再加入100mL H2O和固體NaOH調(diào)反應(yīng)液pH為13～14，加熱至110℃，反應(yīng)7h。待反應(yīng)充分后加入2g活性炭脫色30min，趁熱抽濾得棕褐色水溶液，加濃鹽酸調(diào)其pH為1～2，減壓蒸去溶劑，有大量白色固體析出。在白色固體中加乙醇，過濾將白色物質(zhì)除去，再將濾液減壓旋蒸，得深黃色黏稠狀液體。將液體倒入研缽，加少許石油醚研磨，有淺黃色固體出現(xiàn)，干燥后用異丙醇重結(jié)晶，真空干燥得白色晶體c。

2.1.3 1－羥基－3－（2－丁基－1H－咪唑－1－基）丙烷－1，1－雙膦酸（BIPrDP）的合成 于100mL三頸燒瓶中加入3.92g（0.02mol）c、5.0mL質(zhì)量分數(shù)為85%H3PO4和15mL氯苯，混勻后加熱至110℃，攪拌1h后降溫至65℃，緩慢滴加7.8mL三氯化磷，約30min滴加完畢，升溫到120℃，反應(yīng)8～10h，至下層呈粘稠狀攪不動時，停止反應(yīng)。反應(yīng)液冷卻至室溫，倒去上層氯苯，在100℃下加入30mL 9mol／L的 HCl水解7h。反應(yīng)結(jié)束后，過濾，除去黃色雜質(zhì)，濾液呈黃色，用2～3g活性炭脫色，在100℃下脫色30min。過濾除去活性炭，得到淺黃色澄清透明的液體。將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到少許淺黃色油狀物，待冷卻后，向冷的乙醇中倒入反應(yīng)液，有白色固體析出，攪拌4h后抽濾，得白色固體，干燥后用水重結(jié)晶，真空干燥得白色固體d。

2.2 99Tcm－BIPrDP的制備

99Tcm－BIPrDP 的 合 成 過 程 示 于 圖 2。 取250mg BIPrDP，用1mL 0.1mol／L的 NaOH溶液溶解，加水稀釋至5mL，配成50g／L的BIPrDP鈉鹽溶液，pH 約為6；將10mg SnCl2·2H2O溶于10mL的0.5mol／L的鹽酸中，配成1g／L SnCl2·2H2O溶液。

圖1 BIPrDP的合成路線

圖2 99Tcm－BIPrDP的合成

分別在40、50、60、70、80和90 ℃下，在10mL西林瓶中加入100μL BIPrDP鈉鹽溶液、100μL新鮮配制的SnCl2的鹽酸溶液、1.8mL pH為6的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和新鮮淋洗的Na99TcmO4溶液（37.0MBq）。

2.3 標記率的測定

采用TLC法，以新華一號層析紙為支持物，雙體系為展開劑，體系1為丙酮，體系2為水，展開后用γ計數(shù)儀測量各部分計數(shù)，進而計算出標記率。

99Tcm－BIPrDP在丙酮中Rf＝0～0.1，在水中Rf＝0.8～1.0，99TcmO2在丙酮和水中的Rf＝0～0.1，游離99TcmO4－在丙酮和水中的Rf＝0.9～1.0。

2.4 反應(yīng)速率常數(shù)

99Tcm與 BIPrDP的反應(yīng)如下式［13－16］所示：

假設(shè)反應(yīng)為二級反應(yīng)，則99Tcm（BIPrDP）2（OH）2的生成反應(yīng)速率可以表示為：

其中，a＝ ［99Tcm］0；b＝ ［BIPrDP］0；x＝［99Tcm（BIPrDP）2（OH）2］；k為反應(yīng)速率常數(shù)；t為反應(yīng)時間。

對（1）式積分得，

因為b ≈ 10－2～10－3mol／L，a ≈ x ≈10－8～10－9mol／L，即b?a≈x，b－2x ≈b，b－2a≈b。因此（2）式可簡化為：

x／a為標記率RLY，它可通過放射性測量得到，故可將（3）式改寫為

2.5 反應(yīng)活化能

反應(yīng)活化能與反應(yīng)速率常數(shù)和反應(yīng)溫度均有關(guān)系，這種關(guān)系可用阿倫尼烏斯（Arrhenias）方程表示［13］：

將（5）式兩邊取對數(shù)得

其中，Ea為反應(yīng)活化能；A為頻率因子；T為絕對溫度；R 為氣體常數(shù)（8.314J·mol－1·K－1）。

3 結(jié)果與討論

3.1 BIPrDP的表征

共經(jīng)過三步反應(yīng)，得到白色固體，總產(chǎn)率為23.6% 。mp：148～150 ℃。ESI－MS（m／z）：343（M＋）。1H NMR（400MHz，D2O）：δ7.35（d，1H，CH－ring），δ7.23（d，1H，CH－ring），δ4.36～4.40（t，2H，NCH2），δ2.92～2.95（t，2H，CH2CH2CH2CH3），δ2.32～2.43（m，2H，NCH2CH2，JC－P＝13.79Hz），δ1.64～1.71（m，2H，CH2CH2CH3），δ1.27～1.35（m，2H，CH2CH3），δ0.83～0.86（t，3H，CH2CH3）。C10H20N2O7P2元素分析值 （計算值）／%：C，35.06（35.10）%；H，5.92（5.89）%；N，8.17（8.19）%。以上數(shù)據(jù)說明合成的產(chǎn)物為設(shè)計合成的化合物BIPrDP。

3.2 標記率與反應(yīng)時間的關(guān)系

不同溫度下標記率與反應(yīng)時間的關(guān)系示于圖3。由圖3可以看出，反應(yīng)溫度對99Tcm－BIPrDP的標記率影響很大。在40℃時，反應(yīng)達到平衡時標記率僅為約50%；在60℃時，達到75%左右；只有當溫度升高到90℃時，反應(yīng)平衡時的標記率才能明顯超過90%。另外，由圖3也可以看出，雖然在不同的溫度下，99Tcm－BIPrDP的最大標記率有很大的不同，但它們所達到平衡的時間卻比較相近，均是在幾十秒內(nèi)完成。這種關(guān)系，可以依據(jù)物理化學中的化學反應(yīng)動力學和化學反應(yīng)熱力學知識加以進一步研究。

3.3 反應(yīng)速率常數(shù)的計算

由反應(yīng)速率常數(shù)推導(dǎo)出的（4）式表明，以ln（1－RLY）－1對t作圖應(yīng)得一直線，直線斜率為K，結(jié)果示于圖4。對圖4進行線性擬合，可知，在6個不同溫度下，ln（1－RLY）－1與t都呈良好的線性關(guān)系。40 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.018 3t＋0.329，r2＝0.980 4；50 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.020 7t＋0.723，r2＝0.996 1；60 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.024 1t＋0.872，r2＝0.990 5；70℃時，ln（1－RLY）－1＝0.027 0t＋1.041，r2＝0.993 7；80 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.028 8t＋1.814，r2＝0.986 7；90 ℃時，ln（1－RLY）－1＝0.031 9t＋2.261，r2＝0.999 3。

圖3 標記率（RLY）與反應(yīng)時間的關(guān)系

各溫度下直線的斜率即為該溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)，即在40、50、60、70、80和90℃下的反應(yīng)速率常數(shù)k分別為0.018 3、0.020 7、0.024 1、0.027 0、0.028 8和0.031 9。

圖4 ln（1－RLY）－1和反應(yīng)時間（t）的關(guān)系圖

將溫度從40℃升高到60℃，反應(yīng)速率常數(shù)k增大了約1.32倍；將溫度從50℃升高到70℃、60℃升高到80℃和70℃升高到90℃時，反應(yīng)速率常數(shù)k分別增大了約1.30倍、1.20倍和1.18倍。這表明在低溫下升高反應(yīng)溫度比在高溫下升高反應(yīng)溫度對反應(yīng)速率的影響要大一些。

99Tcm－BIPrDP的制備反應(yīng)是一個較為復(fù)雜的反應(yīng)，包含著還原反應(yīng)和配合反應(yīng)。首先SnCl2把锝從高價還原到低價，在還原反應(yīng)中，99TcmO4－的初始濃度為a≈10－8～10－9mol／L，SnCl2的濃度約為10－3～10－4mol／L，SnCl2的用量較99TcmO4－大幅過量，99Tcm卻能以極高的標記率穩(wěn)定住相應(yīng)標記物的氧化態(tài)，該溶液中的99Tcm僅有3%以下被還原分解為99TcmO2等雜質(zhì)［17］，說明此還原反應(yīng)發(fā)生很快，而且轉(zhuǎn)化率大于97%；之后低價99Tcm再和BIPrDP發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，BIPrDP的初始濃度為b≈10－2～10－3mol／L，b?a，符合準一級反應(yīng)條件，在整個反應(yīng)過程中BIPrDP的濃度可視為常數(shù)，可并入速率常數(shù)項，則此反應(yīng)可稱為準一級反應(yīng)［18］。

3.4 反應(yīng)活化能的計算

根據(jù)（6）式可以看出，以lnk對1／T作圖應(yīng)是一條直線，斜率為－Ea／R，由斜率可以求出反應(yīng)活化能Ea。lnk與1／T的關(guān)系示于圖5。圖5顯示，lnk與1／T之間存在著良好的線型關(guān)系，采用最小二乘法進行線性回歸，得到lnk與1／T的線性方程為：

由式（7）可以求得反應(yīng)活化能 Ea：Ea＝－1 267.1×（－8.314）＝10.53kJ·mol－1。

圖5 lnk與1／T的關(guān)系

與一般反應(yīng)活化能的典型值20～150kJ·mol－1相比，99Tcm－BIPrDP的制備反應(yīng)所需的活化能很低，即反應(yīng)要克服的勢能壘較低，反應(yīng)更易進行［19］。據(jù)文獻［20］報道，99Tcm－BIDP 的反應(yīng)活化能為10.45kJ·mol－1。表明此類99Tcm標記唑來膦酸衍生物制備反應(yīng)的活化能相差不大。計算出本反應(yīng)的反應(yīng)活化能數(shù)值較小，說明本反應(yīng)的反應(yīng)速率很快，也驗證了本反應(yīng)在較短時間內(nèi)即可達到平衡的事實。

3.5 反應(yīng)熱與平衡標記率的計算

3.3節(jié)的研究結(jié)果表明，99Tcm－BIPrDP的制備反應(yīng)為準一級反應(yīng)，即總反應(yīng)表現(xiàn)為對99TcmO4－是一級反應(yīng)［21］。用c 表 示反應(yīng)初始99TcmO4－濃度，xe表示反應(yīng)達到平衡時99Tcm－BIPrDP的濃度。由于c約為10－8～10－9mol·L－1，即濃度很低，標記反應(yīng)涉及的其它常量反應(yīng)物和生成物的濃度及溶液的離子強度近似不變，標記反應(yīng)的平衡常數(shù)Kθ可表示為99Tcm的分配比乘以一個常數(shù)Q，即Kθ＝DQ，令Kp＝Kθ／Q，則Kp＝D。

因此，該反應(yīng)的平衡常數(shù)Kp表示為：

（8）式中，RLY＝xe／c表示平衡時99Tcm－BIPrDP的標記率，即在一定溫度下99Tcm－BIPrDP的最大標記率。

根據(jù)吉布斯－亥姆霍茲公式推得平衡常數(shù)Kp與反應(yīng)熱△H的關(guān)系為：

式中，C為常數(shù)；R 為氣體常數(shù)（8.314J·mol－1·K－1）。在反應(yīng)溫度變化不大的情況下，△H 可看成常數(shù)。將（8）式代入（9）式，得到99Tcm－BIPrDP的平衡標記率（RLY）與反應(yīng)溫度的關(guān)系為：

由（10）式可以看出，ln［RLY／（1－RLY）］與1／T 存在著良好的線性關(guān)系，將40、50、60、70、80和90℃下達到平衡的ln［RLY／（1－RLY）］對1／T 作圖，可得，△H＝51.71kJ·mol－1，C＝19.84，故ln［RLY／（1－RLY）］＝－6 218.4／T＋19.84。將 RLY＝90%代入可得T＝352.46K，即T＝79.31℃。

當標記率達到90%時，最低反應(yīng)溫度是79.31℃。說明滿足標記要求的最低反應(yīng)溫度閾值是79.31℃。

4 小 結(jié)

99Tcm－BIPrDP的制備反應(yīng)為準一級反應(yīng)。99Tcm－BIPrDP的制備反應(yīng)受溫度的影響較大，標記率隨著溫度的升高而逐漸變大。根據(jù)放射性藥物的臨床使用要求，放射性藥物的標記率應(yīng)在90%以上，滿足這一要求的最低反應(yīng)溫度閾值為79.31℃，達到平衡的時間僅為20s。與99Tcm－MIBI在100℃條件下3min達到平衡相比，99Tcm－BIPrDP達到平衡所需的時間短，應(yīng)用更為方便。因此，考慮到臨床的需要、操作簡單等，只需在沸水浴（100℃）下反應(yīng)片刻即可完成。

［1］ 孫達.放射性核素骨顯像［M］.杭州：浙江大學出版社，2000：12－24.

［2］ 王洪勇，羅世能，謝敏浩，等.新型骨顯像劑99Tcm－ZL的制備和動物實驗研究［J］.核技術(shù)，2006，29（6）：438－441.

［3］ 葉德華，王韻，周佳龍，等.骨骼顯像劑—次甲基二膦酸（MDP）的合成和標記［J］.核技術(shù)，1980，3：47－49.

［4］ Jaeggi KA，Widler L.Substituted alkanediphosphonic acids and pharmaceutical use：United Stated，4939130［P］.1990－07－03.

［5］ Wang Y，Luo SN，Lin JG，et al.Animal studies of99mTc－i－PIDP：A new bone imaging agent［J］.Applied Radiation and Isotopes，2011，69（9）：1 169－1 175.

［6］ Lin JG，Luo SN，Chen CQ，et al.Preparation and preclinical pharmacological study on a novel bone imaging agent99Tcm－EMIDP［J］.Applied Radiation and Isotopes，2010，16（9）：1 616－1 622.

［7］ 羅世能，王洪勇，謝敏浩，等.99Tcm－MIDP的制備及其生物學分布［J］.中華核醫(yī)學雜志，2005，25（6）：341－343.

［8］ 牛國塞，羅世能，嚴孝紅，等.99Tcm－EIDP的制備及生物學分布［J］.核技術(shù)，2008，31（9）：698－701.

［9］ Chen CQ，Luo SN，Lin JG，et al.99Tcm－PIDP as bone imaging agent［J］.Nuclear Science and Techniques，2009，20（5）：302－306.

［10］王洪勇，羅世能，劉曉亞，等.唑來膦酸的合成方法改進［J］.江南大學學報：自然科學版，2004，3（6）：611－613.

［11］Widler L，Jaeggi KA，Glatt M，et al.Highly potent geminal bisphosphonates from pamidronate disodium （Aredia）to zoledronic acid （zometa）［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2002，45（17）：3 721－3 738.

［12］郝二軍，廉潔，蘇永祥.唑來膦酸鈉的合成工藝改進［J］.化學試劑，2009，31（5）：383－385.

［13］羅世能，謝敏浩，方平，等.99Tcm－MIBI制備反應(yīng)動力學的研究［J］.核技術(shù)，1992，15（5）：296－299.

［14］魏毅，王學斌，劉伯里，等.99Tcm－葡庚糖酸鹽與甲酯基異丙異腈配體交換動力學研究［J］.核技術(shù)，1990，13（7）：445－448.

［15］吳春英，羅世能，方平，等.EC與99Tcm－GH 之間的配體交換反應(yīng)動力學研究［J］.核技術(shù)，1995，18（5）：293－296.

［16］Kung HF，Liu BL，Pan S.Kinetic study of ligand exchange reaction between99Tcm－glucoheptonate and N－benzyl－N－methyl－piperazinyl－bis－（aminoethanethiol）（BPA－BAT）［J］.Applied Radiation and Isotopes，1989，40（8）：677－681.

［17］魏毅，劉伯里，王學斌.锝化學研究Ⅳ：锝的氧化態(tài)［J］.核化學與放射化學，1990，12（4）：203－207.

［18］胡啟山.二級反應(yīng)動力學特征分析［J］.達縣師范高等?？茖W校學報：自然科學版，2004，14（5）：33－34.

［19］張新華，錢曉良，占昌朝.新型二氧化鉛電極降解苯胺廢水的動力學研究［J］.天津化工，2005，19（3）：15－17.

［20］王燕.系列99Tcm－唑來膦酸衍生物的合成及構(gòu)效關(guān)系研究［D］.無錫：江南大學化學與材料工程學院，2011.

［21］謝敏浩，羅世能，方平，等.99Tcm－MIBI制備反應(yīng)熱力學的研究［J］.核技術(shù)，1993，16（5）：313－314.