李雙鳳 王亞平 冉 珂 唐正國 王 丹 肖艷英

近年來研究發(fā)現(xiàn)，通過激活線粒體ATP敏感性鉀通道[mitoK（ATP）]，可引起線粒體鉀離子內(nèi)流，線粒體膜去極化而降低膜電位，降低鈣攝取驅(qū)動力，抑制Ca2+內(nèi)流，有效防止線粒體鈣超載，減輕細(xì)胞缺血再灌注（I/R）損傷[1]。有報道硫化氫（H2S）能增加心肌細(xì)胞ATP敏感性鉀通道[K（ATP）]的開放率，對抗缺血損傷[2]。本研究探討硫化氫預(yù)處理的延遲相對大鼠心肌的保護(hù)作用及mitoK（ATP）對此作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠32只，級別SPF/VAF，體質(zhì)量300～320 g，購自湖南斯萊景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。NaHS、伊文思藍(lán)、氯化硝基四氮唑蘭（TTC）和5-羥葵酸（5-hydroxydecanoate，5-HD）均購自美國SIGMA公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。假手術(shù)組（Sham組）：行冠狀動脈穿線但不結(jié)扎；心肌缺血再灌注組（IR組）：開胸結(jié)扎左冠狀動脈前降支（LAD）30 min，松解后再灌注2 h；硫化氫預(yù)處理組（HS組）：靜脈注射硫化氫供體NaHS 50 μg/kg，24 h后同IR組處理；5-HD+HS組（HD組）：結(jié)扎前15 min靜脈注射5-HD 5 mg/kg，其他同HS組處理。

1.2.2 缺血再灌注模型建立 大鼠經(jīng)腹腔推注3%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，多導(dǎo)聯(lián)心電監(jiān)測。氣管插管，動物呼吸機(jī)控制呼吸，潮氣量8～10 mL/kg，頻率70次/min。在心尖搏動最明顯處之上一肋間隙開胸，切開心包，確認(rèn)左冠狀動脈圓錐支，在圓錐支之后用7-0絲線結(jié)扎LAD，立即可見左室前壁紫紺充血，心率減慢，血壓一過性下降，心電圖監(jiān)測S-T段明顯抬高，確認(rèn)阻斷成功。

1.2.3 檢測指標(biāo) （1）心肌梗死（心梗）面積。4組各取6只大鼠于再灌注末再次阻斷LAD，經(jīng)頸內(nèi)動脈逆向注入1%伊文思藍(lán)2 mL行心肌染色，充分染色后迅速剪下心臟，低溫生理鹽水沖洗后將左心室切成厚約2 mm的切片。血供正常心肌呈藍(lán)染，缺血心肌呈磚紅或蒼白。將心肌置于37℃10%TTC中水浴15 min。正常心肌呈藍(lán)色，缺血區(qū)未梗死心肌呈紅色，梗死心肌組織為白色。切片進(jìn)行數(shù)碼照相，采用圖像分析軟件Image-ProPlus 6.0分別測定藍(lán)色、紅色、白色區(qū)域面積。左心室面積（left ventricle，LV）為藍(lán)色、紅色和白色面積之和；缺血面積（area at risk，AAR）為紅色和白色面積之和；梗死區(qū)面積（infarct size，IS）為白色面積。缺血面積百分比（AAR/LV）=（缺血面積/左心室面積）×100%，梗死面積百分比（IS/AAR）=（梗死面積/缺血面積）×100%。（2）心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。每組其余2只大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時剪取心臟，在冠脈結(jié)扎處下0.5 cm處剪取約1 mm×1 mm×1 mm左心室組織，2.5%戊二醛固定2 h后，送湘雅醫(yī)學(xué)院超微病理室，經(jīng)清洗、固定、梯度脫水、包埋后，在80℃恒溫箱內(nèi)放置10 h聚合，修組織塊，做超薄切片，用醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色各10 min，用荷蘭FEITecnaiG212型透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，并拍片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌缺血面積與梗死面積比較 除Sham組外，各組心肌缺血面積百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與IR組和HD組比較，HS組梗死面積百分比減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），IR組與HD組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1、圖1。

表1 各組心肌缺血面積及心肌梗死面積比較（%±s）

表1 各組心肌缺血面積及心肌梗死面積比較（%±s）

**P<0.01

IR組HS組HD組F 666 44.16±6.88 45.03±7.24 43.25±6.69 0.038 39.27±5.64 25.40±3.54 38.53±5.24 7.898**組比IR∶HS IR∶HD HS∶HD P 0.005 0.662 0.011統(tǒng)計學(xué)處理組別 n AAR/LV IS/AAR

2.2 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) Sham組心肌超微結(jié)構(gòu)正常。IR組心肌肌原纖維排列紊亂、大面積斷裂、融合、消失，肌節(jié)結(jié)構(gòu)不清；線粒體形態(tài)異常，排列紊亂，腫脹，消失成空泡。HS組心肌肌原纖維排列較整齊，肌節(jié)長短較一致，明帶、暗帶仍可見；線粒體輕度腫脹，膜較完整，少量融合形成空泡；與IR組相比，線粒體損傷程度明顯減輕。HD組與IR組差異不大，見圖2。

3 討論

H2S是一種無色臭雞蛋味氣體，以氣體及NaHS 2種形式存在體內(nèi)。NaHS在體內(nèi)可分解為Na+及HS-，HS-與體內(nèi)H+結(jié)合生成H2S。H2S作為第3種氣體信號分子，在心血管系統(tǒng)的研究價值近來倍受關(guān)注，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[3]、抑制氧化應(yīng)激損傷[4]、減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載[1]，并能激活細(xì)胞信號通路[5]，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。H2S是至今發(fā)現(xiàn)唯一的內(nèi)源性血管平滑肌細(xì)胞K(ATP)開放劑[6]。有研究表明，H2S可通過抑制Fas蛋白表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)使心肌細(xì)胞凋亡減少[7]。

多項研究還表明mitoK（ATP）可能是缺血預(yù)處理的共同終末途徑。缺血預(yù)處理減少細(xì)胞凋亡，減輕再灌注后心律失常和心肌梗死面積，以及其他心肌保護(hù)等作用都是通過激活mitoK（ATP）實(shí)現(xiàn)的。Johansen等[8]報道，mitoK（ATP）阻斷藥5-羥基癸酸甘油酯能完全拮抗H2S預(yù)處理對離體大鼠心臟的保護(hù)作用，表明激活mitoK（ATP）能縮小心肌梗死面積，在細(xì)胞缺血、缺氧時起保護(hù)作用。本研究通過給予鉀通道阻斷劑5-HD，提示與HS組相比，HD組心肌梗死面積明顯增加，心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)線粒體損傷明顯加重，說明H2S開放mitoK（ATP）的作用被阻滯，其抗缺血再灌注性心肌損傷作用被削弱。

結(jié)合相關(guān)研究[9-11]，H2S心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制為：（1）腺苷二磷酸（ADP）一般通過線粒體內(nèi)膜表面的肌酸激酶和腺苷酸載體之間的功能耦聯(lián)部位進(jìn)入線粒體膜，鉀離子內(nèi)流引起的線粒體基質(zhì)容積增加可對這一功能耦聯(lián)產(chǎn)生保護(hù)作用，導(dǎo)致ADP不能進(jìn)入線粒體，線粒體只能磷酸化肌酸，通過減少線粒體ATP的消耗來減輕細(xì)胞能量代謝。（2）調(diào)節(jié)線粒體基質(zhì)容積：線粒體是生物能量代謝的重要場所，其基質(zhì)容積的改變直接影響能量代謝狀態(tài)。缺血缺氧時線粒體基質(zhì)減少，引起膜間腔擴(kuò)張，使該部位結(jié)構(gòu)紊亂、內(nèi)膜成分釋放或消除。鉀離子通道打開促進(jìn)鉀離子內(nèi)流，由此線粒體基質(zhì)容積增加，激活電子傳遞鏈，促進(jìn)線粒體呼吸和ATP合成增加。同時伴隨其他離子的進(jìn)入，達(dá)到滲透壓和電位平衡。此過程伴有水分的進(jìn)入，從而引起基質(zhì)容量的增加，對抗基質(zhì)減少及其所引起的呼吸抑制。（3）鉀離子通道的開放，使鉀離子內(nèi)流進(jìn)入線粒體，降低了內(nèi)膜電位差，減小了鈣離子內(nèi)流動力。同時，鉀離子通道的開放使部分鈣離子從線粒體進(jìn)入胞質(zhì)，減輕了線粒體鈣超載，增加了胞漿內(nèi)的鈣離子濃度，引起蛋白激酶C激活，從而對心肌產(chǎn)生預(yù)處理保護(hù)。

綜上所述，H2S預(yù)處理延遲相能夠減輕在體大鼠心臟缺血/再灌注損傷，且這種保護(hù)作用與其開放線粒體ATP敏感性鉀通道有關(guān)。但細(xì)胞損傷可能還存在其他途徑。因此，如何評價硫化氫的心肌保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。

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