梁麗英 陳 晶 賀 毅

阿霉素（adriamycin，ADM）用于治療各種惡性腫瘤。但是，由于其具有明顯的心臟毒性，臨床應(yīng)用受到限制。阿霉素心臟毒性與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體起著關(guān)鍵性的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡的早期階段，細(xì)胞發(fā)生病理改變前，線粒體膜電位就已經(jīng)下降，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)[1]。黃芪注射液對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位下降有抑制作用[2]。本研究旨在探討其拮抗阿霉素心臟毒性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 阿霉素（注射用鹽酸多柔比星10 mg/瓶，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：090201B）；黃芪注射液（2 g/mL，正大青春寶有限公司，批號(hào)：0901073）。JC-1細(xì)胞線粒體膜電位試劑盒（5 mg/瓶，美國(guó)Biovision，批號(hào)：ENZ-52304）。還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（100T，批號(hào)：20100302，南京建成生物工程技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠60只（廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SCXK桂-2003-0003），雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量18～20 g。

1.3 儀器設(shè)備 流式細(xì)胞分析系統(tǒng)（美國(guó)BECKAN COUL?TER公司，型號(hào)：Epics XL）；移液器（德國(guó)EPPENDORF公司）；756型紫外分光光度計(jì)（上海菁華儀器廠）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 采用隨機(jī)平行同期對(duì)照的方法，建立小鼠阿霉素中毒性心肌損傷（ADR）動(dòng)物模型。60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為黃芪注射液治療組（大、中、小3個(gè)劑量組）、阿霉素模型組和正常對(duì)照組。正常對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水10 μL/g；阿霉素模型組，隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g；黃芪注射液治療組，隔日腹腔注射阿霉素3 μg/g，另外大、中和小劑量組每日腹腔分別注射黃芪注射液12、6和3 μg/g。所有動(dòng)物均自由飲食。連續(xù)給藥14 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法 （1）心臟系數(shù)測(cè)定：稱取小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，處死后取出心臟，用電子分析天平準(zhǔn)確稱量全心濕質(zhì)量，計(jì)算心臟系數(shù)（全心濕質(zhì)量/體質(zhì)量）。（2）心肌組織中GSH的檢測(cè)：取心肌約50 mg，置于預(yù)冷的PBS中，洗去殘留血液，用濾紙吸干水分，在4℃冰浴中制備10%的心肌組織勻漿，低溫離心3 000 r/min，30 min，取上清比色法檢測(cè)GSH。（3）心肌細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)：取心臟約50 mg，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)的濃度為106個(gè)/mL。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，將100 μL細(xì)胞懸液（106個(gè)/mL）加入5 mL的流式測(cè)定管中，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照管。在測(cè)定管中加入1 μL JC-1工作液，陰性對(duì)照管不加。輕輕混勻。將測(cè)定管和對(duì)照管置于37℃培養(yǎng)箱中孵育15～20 min；吸取500 μL PBS緩沖液分別加入測(cè)定管和對(duì)照管中，上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀激發(fā)波為488 nm，紅色熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)為580/590 nm，綠色熒光的最大發(fā)射波長(zhǎng)為510/527 nm，以紅/綠熒光強(qiáng)度比值代表細(xì)胞線粒體膜電位，圖像采用Cell Quest軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心臟系數(shù)結(jié)果 各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與正常對(duì)照組比較，黃芪注射液小劑量組心臟系數(shù)偏大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與黃芪注射液大劑量組、中劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,見(jiàn)表1。

2.2 心肌組織中GSH檢測(cè)結(jié)果 各組分別與阿霉素模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；黃芪注射液各劑量組相互比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

2.3 線粒體膜電位 阿霉素模型組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；黃芪注射液各劑量組與正常對(duì)照組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見(jiàn)表3。

表1 黃芪注射液對(duì)ADR小鼠心臟系數(shù)的影響 ±s）

表1 黃芪注射液對(duì)ADR小鼠心臟系數(shù)的影響 ±s）

**P<0.01

正常對(duì)照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 4.11±0.10 4.44±0.14 4.18±0.13 4.21±0.16 4.24±0.18 7.140**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001 0.193 0.104 0.036<0.001組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P<0.001 0.003 0.624 0.411 0.738統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組別 n 心臟系數(shù)（mg/g）

表2 黃芪注射液對(duì)ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s）

表2 黃芪注射液對(duì)ADR小鼠心肌組織GSH的影響±s）

**P<0.01

正常對(duì)照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 3.99±0.47 2.02±0.22 2.77±0.16 2.88±0.56 2.67±0.28 36.118**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P<0.001<0.001 0.609 0.550 0.270統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組別 n GSH（mg/g）

表3 黃芪注射液對(duì)ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s）

表3 黃芪注射液對(duì)ADR小鼠線粒體膜電位的影響±s）

**P<0.01

正常對(duì)照組（1）阿霉素模型組（2）黃芪大劑量組（3）黃芪中劑量組（4）黃芪小劑量組（5）F 12 10 12 12 12 1.86±0.22 0.88±0.27 1.43±0.16 1.33±0.18 1.07±0.14 40.523**組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）P<0.001<0.001<0.001<0.001 0.027組比（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）P 0.001<0.001 0.002<0.001 0.211統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組別 n線粒體膜電位（FL2/FL1）

3 討論

心肌細(xì)胞凋亡可直接導(dǎo)致心臟動(dòng)力來(lái)源減少,凋亡細(xì)胞局部纖維化可誘發(fā)心律失常。線粒體跨膜電位（mitochondrial membrane potential）紊亂是細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)事件之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要事件，其可導(dǎo)致在線粒體膜上形成孔洞，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中。線粒體內(nèi)容物釋放的調(diào)控被認(rèn)為與線粒體膜上一種稱為permeability transition pore（PT pore）的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔有關(guān)，此孔道打開會(huì)造成線粒體內(nèi)膜兩側(cè)H+梯度消失、線粒體膜電位下降，造成線粒體漲大，外膜漲破之后細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞液中引起細(xì)胞凋亡[3]。線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡的特征性標(biāo)志，維持正常的線粒體膜電位是抑制細(xì)胞凋亡的重要手段[4]。本研究選用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1），它是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)（ma?trix）中，形成聚合物（J-aggregates），可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體（monomer），可以產(chǎn)生綠色熒光，這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。紅綠熒光的相對(duì)比例常用來(lái)衡量線粒體膜電位。本研究結(jié)果顯示，黃芪注射液能穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜電位，抑制膜電位下降，減緩心肌細(xì)胞凋亡。

線粒體是能量產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，在產(chǎn)生能量的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基（ROS），ROS過(guò)多會(huì)造成線粒體損傷、膜電位下降、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放和細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子釋放[3]。GSH參與體內(nèi)氧化還原過(guò)程，能和過(guò)氧化物及自由基結(jié)合，以對(duì)抗氧化劑對(duì)巰基的破壞，保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基酶不被破壞，同時(shí)還可對(duì)抗自由基對(duì)重要臟器的損害，是人體組織中用于清除ROS的抗氧化劑。GSH不僅參與細(xì)胞抗氧化反應(yīng)、維持機(jī)體的氧化還原平衡，還參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、機(jī)體免疫應(yīng)答。GSH降低是潛在的凋亡早期激活信號(hào)，隨后產(chǎn)生的ROS促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，即細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞漿內(nèi)的GSH水平會(huì)降低[5]，因此檢測(cè)GSH水平可以判斷和檢測(cè)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示黃芪注射液可提高ADR小鼠細(xì)胞漿內(nèi)GSH，保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制細(xì)胞凋亡。

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