劉 歡 黃國偉 何 冰 楊 陽 趙 琳

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的未分化細(xì)胞[1]。葉酸對于細(xì)胞分裂和組織生長具有極其重要的作用。研究證實(shí)在胚胎發(fā)育早期，補(bǔ)充葉酸能夠有效預(yù)防神經(jīng)管畸形（neural tube defects，NTDs），其作用機(jī)制可能是葉酸激活神經(jīng)系統(tǒng)的生長和分化[2]。NSCs是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一，在蛋白質(zhì)組學(xué)中，神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)也被認(rèn)為是最具潛力的研究熱點(diǎn)[3-4]。雙向凝膠電泳是根據(jù)等電點(diǎn)和分子質(zhì)量對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法[5]，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。本研究旨在通過雙向電泳（2-DE）方法深入研究葉酸對NSCs增殖分化的作用機(jī)制，為探討葉酸防治神經(jīng)退行性疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級孕Sprague-Dawley（SD）大鼠，14～16 d，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM2429無葉酸培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27購于Invitrogen公司；固相pH梯度干膠條（IPG DryStrip，Ph3-10NL）、尿素、硫脲、十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、氨基丁三醇（Tris）、3-[（3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸（CHAPS）、甲叉雙丙烯酰胺、碘乙酰胺、四甲基二乙胺（TEMED）、溴酚藍(lán)、過硫酸胺（APS）、甘氨酸（Glycine）、丙烯酰胺、兩性電解質(zhì)（Bio?lyte3-10）、礦物油、等電聚焦儀（Protein IEF cell）、垂直電泳系統(tǒng)（ProteinⅡ xi Cell）、CHemiDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)及PD?Quest8.0D凝膠圖像分析軟件均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；Benzo?nase核酸酶、Cocktail蛋白酶抑制劑購于Merck公司；5′-溴脫氧尿嘧啶（BrdU）、L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、甘油、溴酚藍(lán)、低熔點(diǎn)瓊脂糖均為Sigma公司產(chǎn)品；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）為Perotech公司產(chǎn)品；兔抗大鼠巢蛋白（nestin）一抗、小鼠抗大鼠BrdU一抗為Santa Crus公司產(chǎn)品；羊抗兔TRITC熒光二抗、山羊抗小鼠FITC熒光二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司；銀染試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 NSCs的培養(yǎng)和分組 （1）按照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行NSCs原代培養(yǎng)，取胎鼠腦皮質(zhì)，剝除腦膜和血管，用培養(yǎng)液沖洗3次，將其剪碎成0.5 mm3，移入DMEM培養(yǎng)液中，吹打數(shù)次，制成單細(xì)胞懸液，過200目尼龍篩網(wǎng)，1 000 r/min離心10 min，去上清，加入NSCs培養(yǎng)液，即DMEM 2429無葉酸培養(yǎng)液（葉酸濃度為0.6 mg/L）與F12培養(yǎng)液按1∶1混合，含B27添加劑2%，上皮生長因子（EGF）20 μg/L，bFGF 20 μg/L，L-谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素和鏈霉素100 U/mL，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，隔天換液。（2）細(xì)胞共分為3組：對照（Control）組葉酸終濃度為4 mg/L；葉酸缺乏（Folate-D）組葉酸濃度為0.6 mg/L；葉酸補(bǔ)充（Folate-L）組葉酸終濃度為8 mg/L。

1.2.2 NSCs的鑒定 增殖第4天，加入終濃度10 mg/L BrdU繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再將NSCs種植于預(yù)先置有多聚賴氨酸涂布蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，并加入含有血清的培養(yǎng)基（DMEM，10%胎牛血清），添加B272%，EGF 20 μg/L，bFGF 20 μg/L，L-谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素和鏈霉素100 U/mL。培養(yǎng)4 h后，Nes?tin和BrdU抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色[6]，共聚焦顯微鏡下觀察NSCs免疫熒光雙標(biāo)記表達(dá)情況。

1.2.3 細(xì)胞全蛋白的提取和定量 培養(yǎng)6 d后，收集細(xì)胞，加入PBS，1 500 r/min離心10 min，棄上清。重復(fù)3次。加入4～5倍體積裂解液，混勻（裂解液成分：7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%CHAPS、1%DTT、0.2%Bio-Lyte3-10、200 U/mL Benzo?nase核酸酶、Cocktail蛋白酶抑制劑）。液氮中反復(fù)凍融3次，每次3 min。加入200 U核酸酶抑制劑，4℃放置15 min。15 000 r/min，4 ℃離心40 min，收集上清，Bradford法對裂解后NSCs蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量。

1.2.4 雙向電泳 參考文獻(xiàn)[7]，每組樣品重復(fù)3次。將樣品和水化液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2%Bio-Lyte，痕量溴酚藍(lán)）混合，總體積400 μL（蛋白上樣量500 μg），常溫被動(dòng)溶脹上樣15 h。等電聚焦程序參數(shù)按如下建立：250 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，5 000 V 3 h，10 000 V，至總伏特·小時(shí)（V·h）達(dá)到80 000。將聚焦后的膠條在SDS平衡液（6 mol/L 尿素，0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，20%甘油，2%SDS）中平衡2次，搖床上振蕩15 min，2次，其中第1次平衡液中加入20 mmol/L的DTT，第2次平衡液中加入100 mmol/L碘乙酰胺。將平衡后的IPG膠條進(jìn)行垂直SDS-PAGE第2相電泳，恒流12 mA 30 min，之后30 mA直至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)膠底線。所得凝膠參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行硝酸銀染色。

1.2.5 凝膠圖像分析 采用CHemiDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)對染色后的2-DE膠進(jìn)行掃描，PDQuest8.0凝膠圖像分析軟件進(jìn)行分析，對同一組標(biāo)本的3個(gè)凝膠圖，選取一張點(diǎn)數(shù)最多，條紋最少的作為參考膠，與另外2個(gè)凝膠圖進(jìn)行匹配，建立該組平均凝膠圖，參照平均凝膠圖進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)檢測，蛋白的相對表達(dá)量用掃描積分光密度值表示，2組間表達(dá)量升高或降低2倍者定義為差異蛋白點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 NSCs的鑒定 培養(yǎng)2～3 d后，可見大小不等的細(xì)胞團(tuán)，較大的細(xì)胞團(tuán)由數(shù)十個(gè)細(xì)胞組成，細(xì)胞邊緣發(fā)亮，折光性強(qiáng)，呈懸浮狀態(tài)，即為神經(jīng)球；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，神經(jīng)球逐漸增大，原代培養(yǎng)至第7天，可形成數(shù)百個(gè)細(xì)胞集落，此時(shí)細(xì)胞排列緊湊，呈桑葚狀。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)記染色后，于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞球內(nèi)的細(xì)胞顯示紅色熒光，細(xì)胞核綠色熒光表明BrdU陽性，見圖1。

2.2 雙向電泳凝膠分離結(jié)果 經(jīng)圖像分析，在pH 3～10區(qū)域，每塊凝膠可分辨874±21（n=3）個(gè)蛋白點(diǎn)，軟件分析結(jié)果見圖2，各組凝膠蛋白點(diǎn)匹配率達(dá)88.5%，見圖3。

圖2 蛋白點(diǎn)計(jì)數(shù)軟件圖

圖3 各組NSC雙向電泳凝膠圖譜

2.3 差異蛋白分析結(jié)果 在pH 3～10的圖譜中，F(xiàn)o?late-D組較Control組出現(xiàn)差異蛋白點(diǎn)6個(gè)，其中2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量降低，4個(gè)蛋白表達(dá)量升高；Folate-L組較Control組出現(xiàn)差異蛋白點(diǎn)3個(gè)，其中2個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量降低，1個(gè)蛋白表達(dá)量升高。

3 討論

2-DE是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的基礎(chǔ)技術(shù)，把高分辨率的等電聚焦和SDS-PAGE電泳結(jié)合在一起，其分離效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的SDS聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，成為用于復(fù)雜蛋白樣品分離的首選方法。

NSCs研究已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究的重要領(lǐng)域。神經(jīng)系統(tǒng)中多能干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)成功，不僅對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后不可再生理論提出了挑戰(zhàn)，而且對于研究腦的發(fā)育、分化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療均具有重要意義。本研究在調(diào)整了雙向電泳中的幾個(gè)關(guān)鍵因素后，獲得了分辨率高、重復(fù)性好的NSCs電泳圖[7]。

腦損傷后神經(jīng)元再生的機(jī)制復(fù)雜，特別是如何控制NSCs定向分化和遷移仍是尚未解決的問題。有研究顯示，葉酸缺乏與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如阿爾茨海默病、認(rèn)知損傷等，但與神經(jīng)退行性疾病之間的關(guān)系和機(jī)制尚不完全清楚[8]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，葉酸可促進(jìn)NSCs的增殖[6]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，葉酸能降低腦缺血大鼠血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平，增強(qiáng)腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，改善神經(jīng)功能[9]。蛋白質(zhì)組學(xué)有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)葉酸通過哪些蛋白促進(jìn)NSCs的增殖分化。由于NSCs樣本的獲得成本較高，在實(shí)驗(yàn)方法上，筆者對NSCs的2-DE條件進(jìn)行了的摸索，在上樣量、等電聚焦條件、樣品裂解液、上樣緩沖液的成分選擇等方面進(jìn)行了優(yōu)化，提高了分析的準(zhǔn)確性。本研究顯示葉酸缺乏和葉酸補(bǔ)充均會(huì)影響NSCs的蛋白表達(dá)，與Control組比較共發(fā)現(xiàn)差異蛋白點(diǎn)9個(gè)，這些蛋白可能與NSCs增殖分化有密切關(guān)系，其分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等信息通過雙向電泳圖獲得了初步確定，還需要進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜鑒定、氨基酸序列分析和數(shù)據(jù)庫的檢索以確認(rèn)為何種蛋白，而這些蛋白在NSCs增殖分化中的具體作用則有待更深入的功能生物學(xué)研究。

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