周海旭，高 晗，曲良苗，李忠海

(1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410001;2.河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

山楂為薔薇科山楂屬(Crataegus L.)植物，其葉片中含有的黃酮類化合物具有降壓、降血脂、軟化血管、增加冠狀動脈流量、助消化等藥理作用.隨著人們健康觀念的更新以及對黃酮類化合物生物活性的認識，其開發(fā)利用已成為目前的一個研究熱點［1］.黃酮類化合物的來源廣泛存在于多種天然植物中，現(xiàn)主要從銀杏葉、葛根等天然植物中提取黃酮，但其含量較低，提取效率受到限制［2］.而中國山楂葉資源豐富，價格低廉，富含黃酮類成分，且含量高于傳統(tǒng)藥食部位果實［3］.本研究以山楂葉為原料，采用有機溶劑提取黃酮抗氧化物質(zhì)，以總黃酮提取量為指標，采用響應面法優(yōu)化山楂葉黃酮的提取工藝條件，既為開發(fā)新型天然抗氧化劑提供可靠的研究數(shù)據(jù)，又可提高山楂樹的經(jīng)濟價值.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

材料:冷凍干燥山楂葉，產(chǎn)于新鄉(xiāng).

藥品:蘆丁、體積分數(shù)95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純.

儀器:可見分光光度計WFJ7200型，尤尼柯(上海)儀器有限公司;恒溫水浴鍋 HH-4，金壇市杰瑞爾電器有限公司;循環(huán)水式真空泵 SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限責任公司;電子天平HZT-A500，福州華態(tài)科學儀器有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 標準品溶液的制備 精密量取在120℃干燥至恒重的蘆丁標準品20 mg，加一定量的體積分數(shù)60%乙醇溶解，放冷，完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)60%乙醇定容至刻度，即得0.2 g·L－1的標準品溶液［4，5］.

1.2.2 蘆丁標準曲線的測定 取1.2.1中的標準品溶液0，2，4，6，8，10，12 mL 分別置于50 mL 比色管中，加質(zhì)量分數(shù)5%亞硝酸鈉溶液1 mL搖勻，放置6 min;加質(zhì)量分數(shù)10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min;加質(zhì)量分數(shù)4%氫氧化鈉試液10 mL，再加體積分數(shù)60%乙醇至25 mL，搖勻，放置15 min，于510 nm處比色測定吸光度，以吸光度為縱坐標，蘆丁含量為橫坐標做標準曲線［6］.

1.2.3 山楂葉中總黃酮含量的測定方法 準確稱量1.00 g山楂葉粉末置于錐形瓶中，在一定溫度下用乙醇提取一段時間后，抽濾;將濾液用體積分數(shù)60%乙醇定容至100 mL容量瓶中，搖勻，作為待測液;取2.50 mL 待測液按 1.2.2 所述方法，測定吸光度.根據(jù)回歸方程，由吸光度計算出被測液中黃酮含量C，然后由C計算出山楂片中總黃酮的含量［7，8］.

山楂葉黃酮提取量/(mg·g－1)=(40×C×10－3/山楂葉重量)×100%

1.3 單因素試驗

1.3.1 提取時間對黃酮提取量的影響 準確稱取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，液料比為30∶1，加入25 mL體積分數(shù)60%乙醇.于 60 ℃ 條件下分別提取 50，60，70，80 和90 min.

1.3.2 液料比對黃酮提取量的影響 準確稱取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中.分別加入液料比為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 的體積分數(shù)60%乙醇60℃條件下回流提取60 min.

1.3.3 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響 準確稱取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，液料比為40∶1，分別加入25 mL體積分數(shù)為50%，60%，70%，80%和90%的乙醇溶液，60℃條件下回流提取60 min.

1.3.4 提取溫度對黃酮提取量的影響 準確稱取1.00 g山楂葉粉5份，分別置于100 mL圓底燒瓶中，液料比為40∶1，用體積分數(shù)70%乙醇分別在40，50，60，70 和 80 ℃條件下提取 60 min.

1.3.5 響應面法優(yōu)化試驗 本試驗采用Design-Expert 7.1.6軟件中的中心組合試驗(Central composite design，CCD)設計原理設計響應面試驗［9］.根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)A、提取溫度B和液料比C 3個因素作為試驗因素，以黃酮提取量為響應值.試驗因素及水平見表1.

表1 山楂葉中黃酮提取響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design for flavonoids extraction from hawthorn

2 結(jié)果與分析

2.1 提取時間對黃酮提取量的影響

由圖1可知，提取時間為60 min吸光度達到最大，超過60 min后呈現(xiàn)下降趨勢，故選擇60 min為最佳提取時間.

圖1 提取時間對黃酮提取量的影響Fig.1 Effects of extraction time on flavonoids yield

2.2 液料比對黃酮提取量的影響

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，黃酮提取量隨液料比的增大而呈上升趨勢，但液料比增大到一定程度后，黃酮提取量逐漸趨于飽和.因此選擇液料比在40∶1左右比較適宜.

2.3 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取量的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分數(shù)的提高，黃酮的提取量逐漸增大.當乙醇體積分數(shù)達到70%時，黃酮的提取量最高.超過該體積分數(shù)后，黃酮的提取量反而下降，所以選擇乙醇體積分數(shù)70%左右比較適宜.

2.4 提取溫度對黃酮提取量的影響

由圖4可知，隨浸提溫度的升高，黃酮提取量逐漸增加.當浸提溫度超過70℃時達到最大值，隨后呈下降趨勢.因此選擇提取溫度在70℃左右比較適宜.

圖4 提取溫度對黃酮提取量的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on flavonoids yield

2.5 山楂葉黃酮提取響應面法優(yōu)化分析

響應面試驗共有17個試驗點，其中12個析因點，5個中心點，設計及結(jié)果見表2.采用響應面分析法分析試驗結(jié)果，得到以黃酮提取量為響應值的回歸方程為:

由表3可知，以黃酮提取量為響應值時，模型P＜0.000 1，表明該二次方程模型顯著.說明該模型可以用于指導山楂葉黃酮提取試驗設計.各因素對黃酮提取量的影響由大到小依次為乙醇體積分數(shù)＞液料比＞提取溫度.響應面分析法的圖形是特定的響應值對應的各因素構成的一個三維空間，可以直觀地反映各因素對響應值的影響，從試驗所得的響應面分析圖上可以分析出它們之間的相互作用［10］，各因素間交互作用的響應面圖見圖5.

表2 山楂葉中黃酮提取響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results for flavonoids extraction from hawthorn

表3 黃酮提取量的ANOVA分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model of flavonoids yield

由圖5可看出，乙醇體積分數(shù)與液料比之間的交互作用對黃酮提取量有極顯著影響，乙醇體積分數(shù)與提取溫度之間的交互作用對黃酮提取量有顯著影響，提取溫度與液料比之間的交互作用對黃酮提取量影響不顯著.

經(jīng)過Design-Expert 7軟件的分析，可以得出山楂片黃酮提取的最佳條件，結(jié)合試驗驗證，確定其最佳提取工藝條件為:乙醇體積分數(shù)65%、提取溫度70℃、提取時間60 min，料液比42∶1.在此條件下黃酮提取量達到 7.44 mg·g－1.

圖5 兩兩因素交互作用對黃酮提取量的影響Fig.5 The pairwise interactive effects of extraction conditions on flavonoids yield

3 結(jié)論

本研究首先通過單因素試驗分別考察乙醇體積分數(shù)、浸提時間、浸提溫度和液料比對山楂葉黃酮提取量的影響，在此基礎上，采用Design-Expert 7軟件的中心組合設計方法設計響應面試驗，建立了數(shù)學模型，得到了較優(yōu)的提取工藝條件.結(jié)合響應面分析得到的數(shù)學模型，預測更優(yōu)的工藝條件，并進行驗證實驗，最后得到了黃酮的最佳提取工藝條件:乙醇體積分數(shù)65%、提取時間60 min、提取溫度70 ℃、液料比42∶1 mL·g－1，在此條件下黃酮提取量可達 7.44 mg·g－1.

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