劉俊青，李佩芳，胡建斌，李建吾，陶 翠

(河南農業(yè)大學園藝學院，河南 鄭州 450002)

黃瓜(Cucumis sativus L.)是世界各地廣泛栽培的蔬菜作物，其栽培面積僅次于番茄、洋蔥和大白菜［1］.中國是黃瓜栽培和生產(chǎn)大國，據(jù)FAO統(tǒng)計，2007年中國黃瓜總產(chǎn)量達2 805萬t，產(chǎn)值4.6億美元，產(chǎn)量和產(chǎn)值均居世界第1位［2］.一般認為，黃瓜起源于印度，中國是黃瓜的次級起源中心之一［3，4］.盡管中國黃瓜資源豐富，分布有華北型、華南型、歐洲溫室型、歐美加工型等不同類型［5］，但黃瓜遺傳背景狹窄是不爭的事實［4，6］，這不利于其雜交育種工作的開展.迄今，多種分子標記(如RAPD，AFLP，ISSR，SSR 等)已應用于黃瓜種質資源研究和遺傳多樣性分析［7］，為其育種研究提供了基礎性遺傳信息，但這些標記往往是擴增基因組中非表達序列或在基因組中隨機擴增，所得到的位點一般與目的基因(控制性狀的基因)相距甚遠，不能反映功能基因的多態(tài)性，這在某種程度上限制了它們的應用.因此，人們期望能夠檢測到基因內多態(tài)性功能位點的分子標記.EST-SSR起源于基因表達序列，其多態(tài)性是基因內微衛(wèi)星位點變異的反映，是一種潛在的功能標記［8］.與常規(guī)的分子標記相比，EST-SSR標記能檢測到基因內的可變位點，而這些位點很可能與該植物的性狀相關，因而可為植物育種提供更有價值的遺傳信息.目前，人們已在多種高等植物中開發(fā)出大量的EST-SSR標記，并發(fā)現(xiàn)這些標記在植物遺傳多樣性分析中具有較好的實用價值［9］.本研究利用前期從黃瓜EST序列中開發(fā)出部分EST-SSR引物［10］，分析不同黃瓜品種的遺傳多樣性，旨在為黃瓜育種中選擇具有真正意義上的多樣性的材料提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料包括21份黃瓜自交系或品種，由河南農業(yè)大學黃瓜遺傳育種課題組提供.這些材料包括 10 份華北型黃瓜(53，57，86，102，107，D01108，D0462，HR，Jinyou30和 Jinyou10)、6 份華南型黃瓜(109，HN007，HN010，HN013，HN016 和 HN022)、4份歐洲溫室型黃瓜(D0351，112，D0442和DZ1)和1份野生種“SHG”.其中，4份歐洲溫室型黃瓜主要引自荷蘭，其他材料是從國內各地收集后選育所得.采用CTAB小量法［11］提取所有黃瓜材料的基因組DNA.

1.2 PCR反應體系和反應程序

SSR引物為從黃瓜EST序列中開發(fā)所得［10］.PCR 反應體系 15 μL，包括 1 × buffer，50 ng 模板DNA，1.5 mmol·L－1MgCl2，200 μmol·L－1dNTPs，0.4 μmol·L－1引物，0.75 U Taq 酶，所有反應在PTC－200型基因擴增儀(MJ Research)上進行.反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性50 s，50～58℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次;最后在72℃保溫8 min.

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染

采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(m丙烯酰胺:V甲叉雙丙烯酰胺=19∶1)電泳，上樣量3 μL，并在凝膠兩側點上Marker(pUC19 DNA/MspI).在250 V電壓下電泳1.5 h，然后按照優(yōu)化的銀染方法染色、照相［12］.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)ANDERSON等［13］報道的方法計算ESTSSR標記的多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)，即 PIC=1－ ∑X2i，其中，Xi表示第i種基因型出現(xiàn)的頻率.將電泳圖上清晰的條帶記為“1”，同一位置無帶或弱帶記為“0”，建立數(shù)字化矩陣.利用NTSYS-pc2.10軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用NEI和LI的方法［14］計算各材料之間的相似系數(shù)，以UPGMA法對材料進行聚類作圖，并進行主坐標(Principal coordinate analysis，PCoA)分析.

2 結果與分析

2.1 EST-SSR引物特征

從前期研究結果［10］中選擇出擴增條帶清晰的15對EST-SSR引物(表1).這15對引物包括11種重復基元，其中二核苷酸重復2種，三核苷酸重復8種，六核苷酸重復1種.基元重復5～16次，引物E41和E50基元重復次數(shù)最低，E56重復次數(shù)最高.所有引物的理論產(chǎn)物大小為155～287 bp.這些引物所在的EST的功能涉及有能量代謝、蛋白質合成、轉錄調控、光合系統(tǒng)等.

2.2 EST-SSR 多態(tài)性

利用15對EST-SSR引物對21份黃瓜材料進行了PCR擴增，結果發(fā)現(xiàn)，所有引物均能檢測到多態(tài)性位點.每對引物所檢測到的等位基因數(shù)在2(EC56)至7(EC31和EC54)之間，總數(shù)65個，平均4.33個(表2).所有引物擴增出的等位基因片段大小均在理論值上下波動，說明等位基因變異主要是由微衛(wèi)星數(shù)量變化所致.引物EC39的擴增帶譜如圖1所示.

PIC值是反映所用引物區(qū)分材料的能力，是衡量引物多態(tài)性的一個重要指標.為了準確評價各引物的多態(tài)性，計算了各對引物的PIC值(表2).引物EC34的 PIC值最高，達 0.748，引物 EC50的PIC值最低，僅為0.177.所有引物的PIC平均值為0.470.按照 BOTSTEIN 等［15］的觀點，當 PIC ＞0.5時，該基因座為高度多態(tài)性，0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態(tài)基因座，PIC＜0.25時為低度多態(tài)性.在所用的15對EST-SSR引物中，8對引物具有高度多態(tài)性，4對引物具有中度多態(tài)性，僅3對引物為低度多態(tài)性.表明選用的15對EST-SSR引物具有較好的多態(tài)性.

表1 15對EST-SSR引物的特征Table 1 Characteristics of 15 EST-SSR primer pairs in cucumber

圖1 EST-SSR引物EC39在21份黃瓜材料中的擴增帶譜Fig.1 Band pattern of EST-SSR primer pair EC39 among 21 cucumber accessions

2.3 黃瓜種質的遺傳多樣性

利用NTSYS-pc2.10軟件分析發(fā)現(xiàn)，21份黃瓜材料的相似系數(shù)變幅為0.608 ～0.980，其中DZ1和102相似系數(shù)最小，可考慮作為一個比較理想的親本組合，Jinyou10和Jinyou30相似系數(shù)大，它們可能是某個親本的雜交后代.所有材料的平均相似系數(shù)為0.797，即平均遺傳距離0.203，證明了黃瓜遺傳背景狹窄.采用UPGMA算法對21份黃瓜種質進行聚類作圖，結果見圖2.在相似系數(shù)為0.732水平上，21份黃瓜材料可明顯分為2類(Ⅰ和Ⅱ類)，其中 4份歐洲溫室型種質(D0442，DZ1，112和D0351)和1份華南型種質HN010聚在I類，其他16份中國本地種質則聚在Ⅱ類.這充分說明外來種質與國內種質遺傳背景差異甚大，而華南型種質HN010很有可能具有歐洲黃瓜種質的血緣.Ⅱ類包括10份華北型種質、5份華南型種質和1份野生種，并可再次細分為A，B，C 3亞類.其中A類包括所有的華北型種質和1份華南型種質109，此類種質平均相似系數(shù)達0.931，說明華北型黃瓜種質遺傳背景十分狹窄.B類種質包括剩余的4份華南型種質(HN022，HN007，HN013 和 HN016)，其中HN016與其他3份種質相似系數(shù)較小，可能是一個比較理想的雜交候選親本材料.C類僅包括1份野生種SHG，它與國內栽培種(華北型和華南型種質)可明顯分開，充分說明了野生種和栽培種的遺傳差異.

表2 15對EST-SSR引物的多態(tài)性Table 2 The polymorphism of 10 EST-SSR primer pairs in cucumber

圖2 基于EST-SSR標記的21份黃瓜材料的聚類圖Fig.2 A dendrogram of 21 cucumber accessions based on EST-SSR markers

為了更好的反映各材料之間的遺傳關系，以EST-SSR標記數(shù)據(jù)對21份黃瓜材料進行了PCoA分析.第1和第2特征向量分別解釋了23.9%和16.0%的變異，前3個特征向量共解釋了50.1%的變異.由圖3可知，21份黃瓜材料可明顯分為3個區(qū)域(Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)，第Ⅰ區(qū)包括所有華北型種質和1份華南型種質109，即圖2中的A亞類;第Ⅱ區(qū)包括4份華南型種質和1份野生種，即圖2中的B亞類和C亞類;第Ⅲ區(qū)包括所有歐洲溫室型種質和1份華南型種質HN010，即圖2中的Ⅰ大類.由此可見，聚類分析圖和PCoA圖對于21份黃瓜材料的劃分基本一致.

圖3 21份黃瓜材料的PCoA圖Fig.3 A PCoA dendrogram of 21 cucumber accessions

3 結論與討論

3.1 EST-SSR標記在黃瓜遺傳多樣性評價中的應用

迄今，RAPD，AFLP，ISSR等分子標記已用于黃瓜遺傳多樣性評價［5，16～18］.在這些報道中，盡管外來種質可與國內種質區(qū)分開，但國內種質則難以按照生態(tài)類型加以區(qū)分.大多研究者認為這可能是由于自由傳粉或人工雜交所導致材料遺傳背景較復雜的緣故.本研究采用EST-SSR標記研究發(fā)現(xiàn)，無論是采用聚類分析還是PCoA分析，絕大部分均可按照地理分布和生態(tài)類型不同加以區(qū)分.例如，4份來自荷蘭的種質可與國內本地材料明顯區(qū)分，華北型種質與大部分華南型種質亦可明顯區(qū)分，在聚類分析圖中野生種SHG與栽培種區(qū)別明顯.這充分說明EST-SSR標記在黃瓜遺傳多樣性研究中具有很好的實用性，而且材料鑒別能力明顯優(yōu)于RAPD，AFLP，ISSR等分子標記.其原因除了采用了具有典型性狀的高代自交系(除品種Jinyou30和Jinyou10)外，很有可能是本研究采用了源于基因表達序列的EST-SSR標記，而這些標記所檢測的變異位點可能與黃瓜某些性狀(如果實性狀)相關.利用EST-SSR標記分析了黃瓜近緣種——甜瓜的遺傳多樣性，結果發(fā)現(xiàn)國內栽培種中的薄皮甜瓜與厚皮甜瓜也能明顯區(qū)分開［19］，這也支持了本研究結果.

3.2 21份黃瓜種質的應用前景

聚類圖和PCoA圖對21份黃瓜種質的劃分基本一致.國內栽培種質主要集中在聚類圖中Ⅱ類和PCoA圖中的Ⅰ/Ⅱ區(qū)，且相似系數(shù)較高，意味著在雜交育種中，以這類種質為親本所獲得的F1代雜交優(yōu)勢不明顯，黃瓜果實增產(chǎn)空間可能十分有限，但可對個別性狀進行改良.例如，HR高抗黃瓜霜霉病，而109低抗霜霉病但綜合性狀優(yōu)良，109×HR子代很可能是抗霜霉病的優(yōu)良品種，從而實現(xiàn)對109抗病性進行改良.野生種SHG基因組包含多種抗病和抗逆基因，由于SHG(聚類圖中Ⅱ－C亞類)與國內栽培種質有一定的遺傳距離，因此SHG與國內栽培種質雜交后的分離群體(F2)將會出現(xiàn)廣泛的基因分離，從中可能選擇到具有抗病和抗逆性的栽培種質.4份國外種質和1份國內種質HN010處于聚類圖Ⅰ類和PCoA圖Ⅲ區(qū)，與其他種質有明顯的區(qū)別，且有較大遺傳距離，以其作為親本與國內栽培黃瓜(特別是華北型種質)進行雜交，不僅有利于實現(xiàn)黃瓜高產(chǎn)育種，還可拓寬國內黃瓜遺傳背景，豐富其基因資源.

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