楊雪峰，姜金慶，孫紅武，歐陽五慶

(1.河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100;3.第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400038)

安全性評價是新藥研發(fā)的必需組成部分，旨在保證臨床用藥的安全性.復(fù)方阿莫西林納米乳(Amoxicillin and Levofloxacin Hydrochloride Nanoemulsion，AMX-LH-NE)是將傳統(tǒng)抗菌藥物阿莫西林(AMX)與鹽酸左氧氟沙星(LH)配伍，以納米乳為藥物載體研制而成的一種新型納米級復(fù)方制劑［1］.據(jù)報道，該制劑對奶牛乳房炎主要病原菌的聯(lián)合抗菌活性強(qiáng)［2］，在獸醫(yī)臨床中有望用于奶牛乳房炎等細(xì)菌感染性疾病的防控.因此，為保證AMX-LH-NE在獸醫(yī)臨床中的安全應(yīng)用，必須對其進(jìn)行臨床前安全性評價研究.本研究利用急性毒性試驗、皮膚刺激性試驗和細(xì)胞毒性試驗，對AMXLH-NE進(jìn)行了體內(nèi)外安全性評價.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 AMX和LH原料藥，購自西安市臨澤科技有限公司;AMX-LH-NE和空白納米乳，參照文獻(xiàn)［1］制備;脫毛劑和PBS溶液，均為自制;DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基，Gibco Invitrogen Corporation生產(chǎn);胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn);胰酶消化液，碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn);二甲基亞砜(DMSO)，Amresco公司生產(chǎn);MTT檢測試劑，碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn).

1.1.2 試驗動物 昆明種小鼠160只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各80只，由西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗動物中心提供.小鼠每籠飼養(yǎng)5只，自由飲水，溫度為(22±2)℃，相對濕度為40% ～70%.健康成年白色家兔48只，體質(zhì)量2～3 kg，由西北農(nóng)林科技大學(xué)實驗動物中心提供，常規(guī)飼養(yǎng)管理，自由飲水.

1.1.3 受試細(xì)胞 乳腺上皮細(xì)胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗室提供.

1.1.4 主要儀器 SW－CJ－1F型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);Olympus CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司);Model550酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司);MCO－15AC型 CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司).

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 (1)預(yù)試驗.試驗方法參照文獻(xiàn)［3］.找出引起小鼠100%和0死亡的劑量.取20只小鼠，隨機(jī)分為2組，每組10只，雌雄各5 只.按0.020 mL·g－1的劑量，1 組灌胃 AMXLH-NE，另1組灌胃空白納米乳.灌胃前12 h禁食、不禁水，灌胃后常規(guī)飼養(yǎng)，并觀察小鼠3 d內(nèi)死亡情況.結(jié)果2組小鼠均無死亡，無法測出其半數(shù)致死量(LD50)，因此采用測定小鼠最大耐受量來測定受試藥物對小鼠的急性毒性作用.(2)最大耐受量試驗參照文獻(xiàn)［4］的方法.取小白鼠140只，隨機(jī)分為7組:對照組、空白納米乳組(3組)和AMX-LH-NE組(3組)，每組20只，雌雄各10只.將空白納米乳和 AMX-LH-NE分別按 0.025，0.030，0.035 mL·g－13 個不同灌胃劑量組口服灌胃給藥 1 d，對照組按 0.035 mL·g－1灌蒸餾水，灌胃前禁食12 h，不禁水，灌胃后常規(guī)飼養(yǎng).連續(xù)觀察7 d內(nèi)動物的中毒反應(yīng)及有無死亡.以死亡為主要指標(biāo)，如有死亡，則以剛不出現(xiàn)死亡組為準(zhǔn)，此時的用藥量即為小鼠的最大耐受量.試驗結(jié)束時稱小鼠的體重，并參照文獻(xiàn)［5］計算灌胃AMX-LH-NE組小鼠的最大耐受量倍數(shù).

1.2.2 皮膚刺激性試驗 皮膚刺激性試驗參照文獻(xiàn)［6］的方法.(1)試驗動物的處理.將健康家兔48只，隨機(jī)分為生理鹽水組、空白納米乳組和AMX-LH-NE組，每組16只，完整皮膚和破損皮膚各8只，雌雄各4只.于給藥前24 h，在家兔脊柱兩側(cè)脫毛，面積為10 cm×5 cm，以無紅斑、水腫及破損為佳.每組用4只家兔(雌雄各2只)進(jìn)行完整皮膚刺激性試驗，另4只(雌雄各2只)建立損傷皮膚模型，方法是在去毛處用無菌針頭劃“井”字，以劃破表皮滲血為宜，并控制左右兩側(cè)皮膚的破損程度基本保持一致.(2)單次給藥(或急性)皮膚刺激性試驗.采用左右側(cè)自身對比，左側(cè)脫毛區(qū)按0.5 mL·只－1涂生理鹽水、空白納米乳或 AMXLH-NE，右側(cè)不涂抹作對照，并用無刺激紗布和膠布固定，每只家兔單籠飼養(yǎng).給藥24 h后，用溫水清洗涂抹部位，去除殘留藥物，觀察記錄去除藥物后1，24，48，72 h時涂抹部位有無紅斑和水腫反應(yīng).涂抹部位參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行評分和評價刺激強(qiáng)度.(3)多次給藥皮膚刺激性試驗.每天定時涂抹給藥1次，連續(xù)涂抹7 d.在每次去除藥物后1 h，觀察記錄涂抹部位有無紅斑和水腫反應(yīng)，其他均同單次給藥皮膚刺激性試驗.

1.2.3 AMX-LH-NE對乳腺上皮細(xì)胞的毒性試驗參照 GB/T 16886.5—2003/ISO 10993—5∶1999，利用四唑鹽比色試驗(MTT比色法)進(jìn)行.(1)細(xì)胞分組.將96孔板分為空白對照組(調(diào)零孔)、正常對照組、DMSO陽性對照組、AMX-LH-NE組、空白納米乳組、AMX-LH水溶液組、阿莫西林(AMX)組和左氧氟沙星(LH)組.每組設(shè)4個復(fù)孔.(2)加入藥物.以每孔1×104個·mL－1接種乳腺上皮細(xì)胞，培養(yǎng)48 h時，棄凈舊培養(yǎng)液，空白對照組和正常對照組分別更換新鮮培養(yǎng)液100 μL，DMSO組中加入100 μL DMSO;其余各組分別加入用新鮮培養(yǎng)液配制的受試藥物100 μL，并使各種藥物的終質(zhì)量濃度分別為 10，50，100，150，200 mg·L－1.每種藥物質(zhì)量濃度設(shè)4個復(fù)孔，每板均設(shè)空白對照孔.加入受試藥物后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞.(3)呈色.細(xì)胞與受試藥物孵育24 h，終止培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，然后每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心棄凈孔內(nèi)培養(yǎng)上清液.每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使甲臜充分溶解.(4)比色.在酶聯(lián)免疫檢測儀上，選擇波長490 nm，測定各孔吸光度值(OD值).(5)細(xì)胞毒性評價.根據(jù)測定的吸光度值，計算細(xì)胞的相對增殖度(Relative growth rate，RGR).然后以正常對照組的RGR作為100%的細(xì)胞增殖度，根據(jù)細(xì)胞毒性分級［8］，評價各受試藥物對乳腺上皮細(xì)胞的毒性.

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗結(jié)果

灌藥后觀察各組小鼠發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠在灌胃后15 min內(nèi)呼吸急促，在30 min內(nèi)精神萎靡，活動減少，蜷縮成堆;灌藥各組小鼠在灌胃后20 min內(nèi)呼吸急促，在1 h內(nèi)精神萎靡，活動減少，蜷縮成堆，其中AMX-LH-NE各組小鼠在灌胃后第2天出現(xiàn)糞便黏稠不成形，且隨灌胃體積的增大而加重，但至第3天時均恢復(fù)正常.之后4 d內(nèi)各組小鼠行為活動正常，最后均無死亡.

試驗結(jié)束時，最大耐受量試驗對最大灌胃劑量組小鼠體重的影響結(jié)果見表1.由表1可知，與對照組相比，空白納米乳組和AMX-LH-NE組對小鼠平均體重的影響均差異不顯著(P＞0.05).處死小鼠，解剖后肉眼觀察心、肝、肺、胃、腎、胰腺、腸、腦等器官均未發(fā)現(xiàn)異常.結(jié)果表明，小鼠的最大耐受量為 0.035 mL·g－1，最大耐受量倍數(shù)為426倍，即相當(dāng)于奶牛(按體質(zhì)量750 kg計算)臨床日用藥量的426倍，提示AMX-LH-NE安全、無毒.

表1 0.035 mL·g－1灌胃劑量時藥物對小鼠體重的影響Table 1 Effect of different drug on body weight of mice at the intragastric administration dose of 0.035 mL·g－1

2.2 皮膚刺激性試驗結(jié)果

AMX-LH-NE對家兔單次給藥皮膚刺激性試驗結(jié)果見表2.AMX-LH-NE和空白納米乳對完整皮膚，均未引起紅斑和水腫刺激反應(yīng)，各觀察時間點的刺激分值均為0，屬無刺激性;AMX-LH-NE和空白納米乳對破損皮膚，在觀察時間點1 h時，刺激分值均為0.5，屬溫和的輕度刺激性，1 h后的刺激分值均小于0.5，屬無刺激性.

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AMX-LH-NE對家兔多次給藥皮膚刺激性試驗結(jié)果見表3和表4.由表3可知，AMX-LH-NE和空白納米乳對完整皮膚多次給藥，均未引起紅斑和水腫刺激反應(yīng)，每天每只動物的平均刺激分值均為0，屬無刺激性.由表4可知，AMX-LH-NE和空白納米乳對破損皮膚每天多次給藥時，均未引起水腫刺激反應(yīng)，在前4 d每天每只動物的平均刺激分值0.50～0.63，屬輕度刺激性;5 d后其平均刺激分值均小于0.5，屬無刺激性;試驗結(jié)束時，每天每只動物平均刺激分值均為0.32，屬無刺激性.

2.3 AMX-LH-NE對乳腺上皮細(xì)胞的毒性

2.3.1 AMX-LH-NE對乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)的影響正常生長的乳腺上皮細(xì)胞均牢固地貼附于培養(yǎng)孔底，處于旺盛的分裂期，可見大量分裂細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目增多(圖1－A).與正常對照組細(xì)胞相比，DMSO陽性對照組細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞圓縮，死亡的圓形細(xì)胞漂浮，且數(shù)量較多，表明DMSO對細(xì)胞有較大的毒性(圖1－B).在各試驗組中，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為200 mg·L－1時，AMX-LH-NE與其他各試驗藥物情況相同，對乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)和生長產(chǎn)生明顯影響，表現(xiàn)為細(xì)胞變得不規(guī)則，生長受抑制，數(shù)量減少，死亡細(xì)胞增多;當(dāng)藥物濃度均為150 mg·L－1時，AMX-LH-NE(圖1 －C)、空白納米乳(圖1－D)、AMX-LH(圖 1－E)、AMX(圖 1－F)、LH(圖1－G)作用細(xì)胞24 h后，除細(xì)胞的生長速度較正常細(xì)胞稍慢外，形態(tài)無明顯變化，對乳腺上皮細(xì)胞的生長無顯著影響;當(dāng)藥物質(zhì)量濃度在10～100 mg·L－1時，各藥物對乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)和生長速度無影響.

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2.3.2 AMX-LH-NE對乳腺上皮細(xì)胞的毒性結(jié)果AMX-LH-NE對乳腺上皮細(xì)胞的毒性結(jié)果見表5.由表5可知，DMSO對乳腺上皮細(xì)胞的毒性大，為4級，不合格;當(dāng)AMX-LH-NE質(zhì)量濃度為200 mg·L－1時，對乳腺上皮細(xì)胞的毒性分級為3級，與AMX-LH相同，其余各試驗藥物的毒性分級均為2級，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)分析，綜合評價均為不合格;當(dāng)AMX-LH-NE質(zhì)量濃度在10～150 mg·L－1時，對乳腺上皮細(xì)胞的毒性分級為0或1級，與空白納米乳、AMX-LH，AMX，LH情況相同，說明在此劑量范圍內(nèi)，各試驗藥物對乳腺上皮細(xì)胞的生長和形態(tài)無不良影響，無毒性作用，合格，使用安全.

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3 結(jié)論與討論

1)急性毒性試驗是安全性評價的重要內(nèi)容.在本試驗中，經(jīng)口灌胃AMX-LH-NE的各組小鼠行為活動、呼吸、糞便的異常情況持續(xù)時間較對照組長，原因可能主要是由于滿負(fù)荷灌胃操作刺激的影響;各灌胃劑量組的小鼠在灌胃后第2天均出現(xiàn)不同程度的糞便黏稠不成形現(xiàn)象，且隨灌胃容積的增加而加重，空白納米乳各組未出現(xiàn)此現(xiàn)象，但腹瀉持續(xù)時間均較短，至第3天均已恢復(fù)正常.結(jié)果表明，AMX-LH-NE毒性低，小鼠的最大耐受量倍數(shù)為426倍.本研究進(jìn)行的皮膚刺激性試驗結(jié)果表明，無論是單次給藥還是多次給藥，AMX-LH-NE對完整皮膚和破損皮膚均無明顯刺激性.

2)本試驗利用MTT比色法研究了AMX-LHNE對乳腺上皮細(xì)胞的毒性影響.結(jié)果表明，當(dāng)AMX-LH-NE質(zhì)量濃度在 10～150 mg·L－1時，對乳腺上皮細(xì)胞的活性和功能狀態(tài)無不良影響;當(dāng)AMX-LH-NE質(zhì)量濃度為200 mg·L－1時，則對乳腺上皮細(xì)胞有一定的毒性作用.由于150 mg·L－1AMX-LH-NE遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AMX-LH-NE對各種奶牛乳房炎主要病原菌的最小抑菌濃度(MIC)［2］.因此，當(dāng)AMX-LH-NE質(zhì)量濃度≤150 mg·L－1時對乳腺上皮細(xì)胞的生物安全性較好.試驗結(jié)果表明，AMXLH-NE安全，無毒，刺激性小，符合臨床用藥的安全性要求.

［1］楊雪峰，歐陽五慶，曹發(fā)昊，等.復(fù)方阿莫西林納米乳的制備及其穩(wěn)定性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，36(12):19－23.

［2］楊雪峰，歐陽五慶，李向輝，等.復(fù)方阿莫西林納米乳對奶牛乳房炎3種主要病原菌的體外聯(lián)合抗菌效應(yīng)［J］.浙江大學(xué)學(xué)報:農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2009，35(5):585－590.

［3］沈建忠.動物毒理學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:38－39.

［4］國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005:209－216.

［5］郭世寧.防治奶牛子宮內(nèi)膜炎新型復(fù)方藥物制劑宮炎清的研究［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002:46－51.

［6］馮秀娟，李忠生，李 冰.皮特芬溶液對家兔皮膚刺激性試驗［J］.中國動物檢疫，2007，24(1):41.

［7］劉昌孝.藥物評價學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:255－257.

［8］趙 娜，魏 坤，苗國厚，等.MTT法評價鑭原位改性HMS材料的細(xì)胞毒性［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(25):4603－4606.