趙明曉，馮志敏，胡 湛，趙振利，范國(guó)強(qiáng)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002;2.信陽(yáng)農(nóng)業(yè)高等專科學(xué)校，河南 信陽(yáng) 464000;3.焦作市園林局，河南 焦作 454003)

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是一種DNA多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù).既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性［1］.目前，在梅花、泡桐、蘋果、白樺和板栗等［2～7］木本植物親緣關(guān)系研究及遺傳多樣性［8］、圖譜構(gòu)建［9～11］、基因定位［12］、品種鑒定［13，14］、雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)和分子標(biāo)記輔助選擇育種［15］等方面得到廣泛應(yīng)用.蠟梅(Chimonanthus praecox)為中國(guó)特有的花卉植物，品種多，具有較高的觀賞價(jià)值.近年來(lái)，研究人員對(duì)蠟梅SRAP［16］，RAPD［17］，ISSR［18］和 SSR［19］等技術(shù)體系進(jìn)行了深入研究，在其AFLP技術(shù)體系方面雖然也有文獻(xiàn)報(bào)道［20～22］，但存在體系不完善等問(wèn)題，并且在目前所建立的體系中都沒(méi)有進(jìn)行引物篩選工作，給蠟梅分子生物學(xué)研究帶來(lái)了很多困難.為深入開展蠟梅分子輔助育種和基因組等研究奠定基礎(chǔ)，作者進(jìn)行了蠟梅AFLP技術(shù)體系優(yōu)化及引物篩選工作.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)校區(qū)中心花壇栽植4 a的素心蠟梅(Chimonanthus praecox)健康植株當(dāng)年生枝條葉片.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠟梅基因組DNA提取 蠟梅基因組DNA的提取參照張延召等［23］的方法，利用紫外分光光度計(jì)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量.

1.2.2 蠟梅AFLP體系優(yōu)化

1.2.2.1 酶切體系 參照曹喜兵等［24］的方法.總體積為 20 μL，包括 600 ng 模板 DNA，0.2 μL 100 × BSA，3 U Pst I，3 U Mse I和2.0 μL 10 × NEB Buffer，加超純水至20 μL.混勻后在PCR儀上37℃分別酶切 1，2，3，4，5，6 h 后，80 ℃失活20 min.然后，分別取其產(chǎn)物5 μL在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠上電泳(4～5 V·cm－1).根據(jù)電泳結(jié)果篩選出最佳酶切時(shí)間.

1.2.2.2 連接體系 接頭(由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)的制備:Pst I接頭(10 μmol·L－1):分 別 吸 取 2 μL 的 Pst I 正 (5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’)、反 (5’-TGTACGCAGTCTAC-3’)接頭，然后加入36 μL的雙蒸水混合至 40 μL;Mse I接頭(100 μmol·L－1):分別吸取20 μL 的 Mse I正(5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’)、反(5’-TACTCAGGACTCAT-3’)接頭，然后混勻.最后把接頭放在離心機(jī)上點(diǎn)離拿出放入4℃冰箱20 min后，放入PCR儀上60℃制接頭.連接體系總體系20 μL，該體系包括15 μL上述酶切產(chǎn)物，0.25 μmol·L－1Pst I 接頭，2.5 μmol·L－1Mse I接頭，不同量(1.0，2.0，3.0，4.0 U)的 T4連接酶及 1 μL 10 × T4Buffer，加去離子水至 20 μL，然后于PCR擴(kuò)增儀上在22℃條件下分別連接8，10，12，14，16，18 h，根據(jù)連接結(jié)果篩選出最佳連接時(shí)間.

1.2.2.3 預(yù)擴(kuò)增體系 (1)連接產(chǎn)物用量?jī)?yōu)化.在各體系中分別加入 5 μL 稀釋為 1，5，10，15，20，25 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq酶，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和 300 μmol·L－1dNTP，然后分別用去離子水補(bǔ)至 20 μL.(2)Mg2+用量?jī)?yōu)化.在各體系中分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1的 Mg2+，5 μL 稀釋10 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和300 μmol·L－1dNTP，分別用去離子水補(bǔ)至20 μL.(3)Taq酶用量?jī)?yōu)化.在各體系中分別加入1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 U 的 Taq 酶，5 μL 稀釋 10 倍連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00 和 300 μmol·L－1dNTP，然后用去離子水補(bǔ)至20 μL.(4)dNTP濃度優(yōu)化.在各體系中分別加入 100，200，300，400，500 μmol·L－1的 dNTP，5 μL 稀釋10 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，0.5 μmol·L－1P00，0.5 μmol·L－1M00和2U Taq酶，然后分別用去離子水補(bǔ)至20 μL.(5)引物濃度優(yōu)化.在各體系中分別加入0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 μmol·L－1預(yù)擴(kuò)增引物 P00 和M00，稀釋 10 倍連接產(chǎn)物 5μL，300 μmol·L－1dNTP，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，用去離子水補(bǔ)至 20 μL.

1.2.2.4 選擇性擴(kuò)增體系 (1)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用量?jī)?yōu)化.在各體系中分別加入 5 μL稀釋5，10，15，20，25，30 倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，0.5 μmol·L－1Pst I引物，0.5 μmol·L－1Mse I引物，2.0 mmol·L－1的Mg2+，300 μmol·L－1dNTP，2 U Taq 酶，加去離子水補(bǔ)至20 μL以進(jìn)行選擴(kuò).(2)Mg2+用量?jī)?yōu)化.在各體系中分別加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1的 Mg2+，5 μL 稀釋 10 倍的連接產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2 U Taq 酶，0.5 μmol·L－1Pst I引物，0.5 μmol·L－1Mse I 引物和 300 μmol·L－1dNTP，分別用去離子水補(bǔ)至 20 μL.(3)Taq 酶濃度優(yōu)化.不同體系中分別加入 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 U Taq 酶，5 μL 稀釋 20 倍預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，0.5μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(引物 9)，300 μmol·L－1dNTP，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去離子水至20 μL.(4)dNTP濃度優(yōu)化.在各體系中分別加入 100，200，300，400，500 μmol·L－1的 dNTP，5 μL 稀釋 20 倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，0.5 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(引物 9)，2 U Taq 酶，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去離子水至 20 μL.(5)引物濃度優(yōu)化.在不同的體系中分別加入 0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物及 5 μL 稀釋20 倍預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，300 μmol·L－1dNTP，2 U Taq酶，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，加去離子水補(bǔ)至20 μL.

1.2.3 引物篩選 利用優(yōu)化后的蠟梅 AFLP體系，對(duì)64對(duì)引物(由奧科生物科技有限公司合成)組合進(jìn)行篩選，篩選出適合蠟梅AFLP的選擇性擴(kuò)增引物.擴(kuò)增程序、PCR選擴(kuò)產(chǎn)物電泳、染色及凝膠掃描參照曹喜兵等［24］的方法，每泳道上樣量為5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物.電泳結(jié)束后，選擇譜帶清晰和數(shù)目較多的引物作為AFLP反應(yīng)的最佳引物.

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟梅基因組DNA的質(zhì)量

利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的蠟梅基因組DNA 的結(jié)果為:A230=0.078;A260=0.314;A280=0.174.A260/280，A260/230，A230/280的值分別為 1.805，4.026，0.448.說(shuō)明提取的 DNA 無(wú)蛋白質(zhì)、RNA 和酚類等小分子物質(zhì)的污染.由DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖1)，DNA片段達(dá)到5 000 bp以上，完全能滿足AFLP分析要求.

圖1 不同DNA量的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 Electrophoresis validation of different concentrations genome DNA

2.2 蠟梅AFLP體系優(yōu)化

2.2.1 酶切反應(yīng)體系優(yōu)化 為了得到更好的選擴(kuò)結(jié)果，選擇600 ng蠟梅進(jìn)行不同時(shí)間酶切處理，其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖2)，經(jīng) 1，2，3，4，5，6 h酶切后，模板DNA皆能被完全切開，并且酶切片段幾乎沒(méi)差別，為保證蠟梅AFLP的后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)選擇2 h為該體系最佳的酶切時(shí)間.

圖2 不同時(shí)間酶切DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of DNA with different enzyme cut times

2.2.2 連接反應(yīng)體系優(yōu)化 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖3)，在反應(yīng)體系中加入3.0 U的T4連接酶，0.25 μmol·L－1Pst I 和 2.5 μmol·L－1Mse I接頭有利于蠟梅AFLP連接效果.在連接時(shí)間分別為8，10，12，14，16，18 h 條件下，隨著連接時(shí)間的增加，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物量逐漸增加，為了試驗(yàn)最佳效果，本體系選擇連接反應(yīng)時(shí)間為12 h.

圖3 不同時(shí)間連接DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of DNA with different connection times

2.2.3 預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化 不同連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)結(jié)果表明(圖4)，連接產(chǎn)物用量對(duì)預(yù)擴(kuò)反應(yīng)有較大影響.當(dāng)連接產(chǎn)物分別稀釋1，5，10倍時(shí)，擴(kuò)增片段大小幾乎相同;當(dāng)連接產(chǎn)物稀釋超過(guò)10倍時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量明顯降低，因此，本體系中蠟梅AFLP預(yù)擴(kuò)增連接產(chǎn)物以稀釋10倍為宜.由不同Mg2+濃度對(duì)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果(圖5)可以看出，當(dāng)Mg2+濃度為0.5 mmol·L－1時(shí)擴(kuò)增出的產(chǎn)物量比較模糊，而 Mg2+濃度分別為 1.0，1.5，2.0，2.5 mmol·L－1時(shí)均能擴(kuò)增清晰的譜帶;但 2.0 mmol·L－1時(shí)譜帶豐寓而且最清晰，擴(kuò)增效果最好.因此，本試驗(yàn)從擴(kuò)增的結(jié)果和成本考慮，確定Mg2+的最優(yōu)濃度為2.0 mmol·L－1.從不同Taq酶量對(duì)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果表明(圖6).當(dāng)Taq酶量為1.0 U時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量較少，但當(dāng)Taq酶量從1.5 U增加到2.5 U時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物明顯增多，并且隨著酶量的繼續(xù)增大，擴(kuò)增產(chǎn)物增加幾乎相同.因此，選擇2.0 U作為蠟梅AFLP預(yù)擴(kuò)增最佳Taq酶用量.由dNTP用量對(duì)預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)可以看出(圖7)，當(dāng)dNTP濃度為 100 μmol·L－1時(shí)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物量較低，當(dāng) dNTP濃度大于200 μmol·L－1時(shí)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物量先升高后降低.這是dNTP與Taq酶對(duì)Mg2+競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，當(dāng) dNTP 濃度為 300 μmol·L－1時(shí)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物量最大.因此，本試驗(yàn)選擇300 μmol·L－1作為蠟梅預(yù)擴(kuò)增最適dNTP濃度.由引物濃度對(duì)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物影響可以看出(圖 8)，當(dāng)其濃度為 0.3μmol·L－1時(shí)，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物量較低，當(dāng)其濃度從 0.5μmol·L－1增加到1.1μmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物增加量幾乎相同.從試驗(yàn)成本考慮，選擇 0.5 μmol·L－1為該體系的最佳引物濃度.

圖9 連接產(chǎn)物稀釋倍數(shù)對(duì)選擴(kuò)影響Fig.9 Effect of connection product diluted times on selective amplification

2.2.4 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化 不同預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋倍數(shù)結(jié)果表明(圖9)，預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物用量對(duì)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)有較大影響.當(dāng)預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物分別稀釋5，10，15，20倍時(shí)，擴(kuò)增片段大小幾乎相同;當(dāng)預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋超過(guò)20倍時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量明顯降低，考慮到節(jié)省樣品，本體系中蠟梅AFLP選擇性擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物選擇稀釋20倍.由不同Mg2+濃度對(duì)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果可以看出(圖10)，當(dāng) Mg2+濃度為0.5 mmol·L－1時(shí)擴(kuò)增出的產(chǎn)物比較模糊，但隨著Mg2+濃度的提高，擴(kuò)增增出的產(chǎn)物量逐漸增加.因此，本試驗(yàn)從擴(kuò)增的結(jié)果和成本考慮，確定Mg2+的最優(yōu)濃度為2.0 mmol·L－1.不同Taq酶量對(duì)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)影響較大(圖11).當(dāng)Taq酶為0.5 U時(shí)，蠟梅AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物量較少，但當(dāng)Taq酶增加到2 U時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量明顯增加.因此，選擇2 U為Taq酶最適用量.dNTP濃度對(duì)于選擇性擴(kuò)增也有較明顯的影響(圖12).當(dāng)dNTP濃度低于200 μmol·L－1時(shí)，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物量較低，當(dāng)dNTP濃度大于200 μmol·L－1時(shí)，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物量先升高后降低.這是由于dNTP與Taq酶對(duì)Mg2+競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果.當(dāng) dNTP 濃度為 300 μmol·L－1時(shí)，選擴(kuò)產(chǎn)物量最大.因此，300 μmol·L－1為蠟梅 AFLP 選擇性擴(kuò)增體系中dNTP濃度的最適濃度.由不同引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可以看出(圖13)，引物濃度對(duì)選擇性擴(kuò)增反應(yīng)有較大的影響.當(dāng)引物濃度為0.3 μmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增量較少，隨著引物濃度增大，擴(kuò)增產(chǎn)量逐漸增多，擴(kuò)增產(chǎn)量趨于穩(wěn)定.因此，本體系中，選取引物適宜濃度為 0.5 μmol·L－1.

2.2.5 蠟梅AFLP選擇性擴(kuò)增引物篩選 用上述方法優(yōu)化出的蠟梅體AFLP反應(yīng)體系，對(duì)64對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，篩選出了96對(duì)引物(表1).結(jié)果表明(圖14)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳譜帶清晰、分辨率高、重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng).因此，這些引物可用來(lái)開展蠟梅的分子生物學(xué)研究.

表1 蠟梅AFLP選擇性擴(kuò)增引物Table 1 Primer for AFLP of the selective amplification

圖14 47對(duì)引物的AFLP選擇性擴(kuò)增圖Fig.14 AFLP of selective amplification with 47 pairs of primers

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)對(duì)蠟梅AFLP體系優(yōu)化，得出其最佳酶切體系(20 μL)為模板 DNA 600 ng，Pst I和Mse I各為3 U，在37℃下雙酶切2 h;在20 μL最佳連接體系中酶切產(chǎn)物為15 μL，3 U T4連接酶，0.25 μmol·L－1Pst I接頭，2.5 μmol·L－1Mse I接頭，1 μL 10 × T4buffer，在 22 ℃ 下連接 10 h;在20 μL最佳預(yù)擴(kuò)反應(yīng)體系中稀釋10倍的連接產(chǎn)5 μL，2.0 mmol·L－1Mg2+，2 U Taq 酶，300 μmol·L－1dNTP，0.5 μmol·L－1Pst I 和 Mse I引物 (P+AGA/M+ATC);在20 μL最佳選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系中5 μL 稀釋 20 倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，2.0 mmol·L－1的 Mg2+，2U Taq 酶，300 μmol·L－1dNTP，0.5 μmol·L－1Pst I和 Mse I引物(P+AGA/M+ATC).此外，經(jīng)引物篩選試驗(yàn)，從64對(duì)引物組合中，選出了96對(duì)引物可用于蠟梅 DNA的 AFLP分析.

蠟梅為木本植物，其葉片中含有大量的酚類、多糖等次生代謝物質(zhì)，嚴(yán)重影響基因組DNA的得率和純度及下游工作的進(jìn)行［21］.本研究針對(duì)蠟梅葉片富含單寧和多糖等物質(zhì)，利用張延召等［23］的方法提取其基因組DNA，可有效去除這些物質(zhì).該方法提取的DNA純度高，片段大，用于AFLP反應(yīng)中，能擴(kuò)增出清晰的條帶，為蠟梅的分子標(biāo)記分析提供了基礎(chǔ).

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