周喜新 ，楊 華 ，張 濱

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

微生物絮凝劑是一類(lèi)由微生物產(chǎn)生的，可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒凝聚、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物。該類(lèi)絮凝劑是一種高效、廉價(jià)、無(wú)毒、無(wú)二次污染的水處理劑，可廣泛應(yīng)用于飲用水處理、廢水處理、食品工業(yè)和發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域[1-3]。但由于生產(chǎn)成本過(guò)高，生物絮凝劑在實(shí)際生產(chǎn)中尚未得到廣泛推廣應(yīng)用。因而尋找廉價(jià)的培養(yǎng)基是生物絮凝劑產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題[4-8]。

醬油作為人們?nèi)粘Ｉ钪械恼{(diào)味品，滿(mǎn)足了人們飲食需要。近年來(lái)由于醬油制造工業(yè)快速發(fā)展導(dǎo)致醬油生產(chǎn)廢水排放量大增，帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。醬油廢水濃度高、負(fù)荷變化大、色度大，屬于難處理有機(jī)廢水。但醬油廢水中含有生物生長(zhǎng)繁殖和代謝所需要的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可用于微生物的培養(yǎng)[9-10]。試驗(yàn)以醬油廢水為培養(yǎng)紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）的替代培養(yǎng)基，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件發(fā)酵生產(chǎn)生物絮凝劑，以期為降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，解決醬油廢水對(duì)環(huán)境的污染問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所）；醬油廢水（湖南寧鄉(xiāng)縣加加醬油廠）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 3 g/L，pH 值 7.0。

廢水培養(yǎng)基：取寧鄉(xiāng)加加醬油廠廢水稀釋至不同濃度，添加不同量碳源，調(diào)pH值到不同值。

1.2.2 發(fā)酵液培養(yǎng)條件 250 mL三角燒瓶中裝100 mL培養(yǎng)基，接種紅平紅球菌，分別在25、30、35℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)96 h。測(cè)定上清液中的絮凝活性。

1.2.3 絮凝劑的制備 在發(fā)酵液中添加 0.5%三氯醋酸+正丁醇（4∶1），靜置 12 h，6 000 r/min 離心15 min，收集上清液。再向上清液中添加2倍體積的95%的乙醇，在4℃條件下靜置24 h，虹吸上清液，收集沉淀物。沉淀物用70%的乙醇洗滌2次，得到生物絮凝劑粗制品。

1.2.4 絮凝率的測(cè)定 在裝有5 g/L的100 mL高嶺土懸濁液中，加入5 mL 1%的氯化鈣溶液作為助凝劑，再加入2 mL的菌株發(fā)酵上清液，調(diào)pH值至7.5，混合攪拌5 min，靜置10 min，用UV-754型分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)550 nm處的吸光度，同時(shí)以2 mL蒸餾水代替菌株發(fā)酵上清液作為對(duì)照，絮凝率計(jì)算公式：絮凝率=（A-B）/A×100% ，其中A為對(duì)照上清液550 nm處的吸光度，B為樣品上清液550 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)絮凝劑的影響

在醬油廢水中添加質(zhì)量濃度為10 g/L的不同碳源，分析其對(duì)絮凝率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳源對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)絮凝劑影響

從圖1可以看出，僅用醬油廢水作為培養(yǎng)基，其絮凝率非常低，而添加少量碳源對(duì)絮凝劑產(chǎn)生的具有顯著的影響。而且以加入葡萄糖的效果最為顯著，其次是加入蔗糖。研究還發(fā)現(xiàn)，加入不同碳源的培養(yǎng)基生產(chǎn)的絮凝劑出現(xiàn)較高活性的時(shí)間不一樣，用葡萄糖和蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基較其它碳源的培養(yǎng)基快出現(xiàn)較高的絮凝活性。因此，發(fā)酵時(shí)可以加入適量的葡萄糖或蔗糖。但考慮到蔗糖價(jià)格遠(yuǎn)低于葡萄糖，生產(chǎn)時(shí)建議加入蔗糖作為碳源，以降低絮凝劑生產(chǎn)成本。

2.2 醬油廢水發(fā)酵生產(chǎn)絮凝劑條件的優(yōu)化

以培養(yǎng)紅平紅球菌的廢水濃度，接種量，溫度，pH值為4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中極差大小能看出，影響紅平紅球菌生長(zhǎng)的因素從大到小依次為：pH值＞廢水濃度＞接種量＞溫度。其中pH值對(duì)絮凝率影響最大，pH值7.0為最優(yōu)。其次影響的因素為廢水濃度，當(dāng)廢水濃度為25%時(shí)，菌產(chǎn)絮凝劑的絮凝效果最好。其可能的原因是廢水中存在某些對(duì)紅平紅球菌有害的物質(zhì)，當(dāng)其濃度過(guò)高時(shí)，抑制菌的生長(zhǎng)；而當(dāng)廢水濃度過(guò)低時(shí)，其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以完全滿(mǎn)足菌產(chǎn)絮凝劑的需要，絮凝率也有所降低。接種量的極差較小，接種量分別為5%，10%和15%時(shí)對(duì)菌產(chǎn)絮凝劑影響不大。溫度對(duì)絮凝劑的產(chǎn)生影響最小?？紤]控溫的成本，生產(chǎn)時(shí)可考慮采用自然溫度。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3 紅平紅球菌發(fā)酵生產(chǎn)絮凝劑的生長(zhǎng)曲線特征

將廢水稀釋4倍，并按10 g/L的濃度加入蔗糖，調(diào)pH值至7.0，30℃培養(yǎng)紅平紅球菌，間隔取發(fā)酵液測(cè)細(xì)胞濃度及絮凝活性。紅平紅球菌的生長(zhǎng)曲線如圖2所示。由圖2可看出，24 h之前，菌體處于適應(yīng)期，菌量無(wú)明顯改變；24至36驗(yàn)h內(nèi)，菌量有所增加，但速度很慢。36 h后紅平紅球菌經(jīng)過(guò)適應(yīng)期后進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)迅速，細(xì)菌數(shù)目以幾何數(shù)增加。廢水培養(yǎng)基發(fā)酵60 h以后，紅平紅球菌生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期，菌的生長(zhǎng)速率下降，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率與死亡速率達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)期，絮凝劑開(kāi)始大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，絮凝劑的生成基本停止?？梢?jiàn)，在醬油廢水培養(yǎng)基中紅平紅球菌絮凝劑生長(zhǎng)曲線模式屬于比較典型的生長(zhǎng)偶聯(lián)型[11-12]。

圖2 紅平紅球菌產(chǎn)絮凝劑與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系

2.4 絮凝劑的產(chǎn)率及絮凝效果

將廢水稀釋4倍，并按10 g/L的濃度加入蔗糖，調(diào)pH值至7.0，30℃培養(yǎng)紅平紅球菌。60 h后發(fā)酵液制備絮凝劑，得率為1.68 g/L。絮凝劑粗品呈白色粉末狀，具有多糖和蛋白質(zhì)性質(zhì)。

取絮凝劑粗品1 g，溶解于100 mL水，取2 mL測(cè)絮凝活性。靜置15 min后，對(duì)照一直比較渾濁，有明顯的懸浮顆粒，無(wú)明顯的絮凝沉淀現(xiàn)象；處理管從加入絮凝劑后就開(kāi)始絮凝，不斷的有白色的絮凝物質(zhì)從管中向底部沉淀。15 min后管中溶液透明清澈，懸浮顆粒很少，絮凝率超過(guò)95%。說(shuō)明絮凝劑的絮凝效果比較理想（圖3）。

圖3 絮凝劑粗品的絮凝效果

3 討論

醬油釀造生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)廢水，隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)的重視，醬油生產(chǎn)的廢水直接排放會(huì)對(duì)周?chē)鷳B(tài)環(huán)境造成惡劣的影響。利用含高濃度有機(jī)物的醬油釀造廢水作為廉價(jià)培養(yǎng)基，既可以充分利用廢水中豐富的營(yíng)養(yǎng)物作為產(chǎn)生生物絮凝劑的碳源和氮源，又可以降低水中的污染物，達(dá)到雙重功效[13]。醬油廢水中的糧食殘留物等可以作為微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵的碳源，但試驗(yàn)表明醬油廢水還需外加少量的糖作為微生物生長(zhǎng)的碳源。而前期的研究表明，醬油廢水中N的含量可達(dá)到1.5 g/L，醬油廢水中富含的蛋白質(zhì)、氨基酸等作為氮源能滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵的需求。研究同時(shí)表明，紅平紅球菌發(fā)酵過(guò)程能有效降低醬油廢水BOD、SS等指標(biāo)，起到處理污水的作用，但對(duì)于醬油廢水的色度改變很小。

[1]張 彤，朱懷蘭，林 哲.微生物絮凝劑的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1996，2（l）：95-105.

[2]陳 曉，王洪媛，楊翔華.微生物絮凝劑研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].撫順石油學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，12，22（4）:27-30.

[3]郭 琇，孫洪偉.新型復(fù)合型生物絮凝劑的制備與應(yīng)用研究[J].生物技術(shù)，2010，20（5）：85-87.

[4]蘆 艷，喬福珍，孟麗麗.利用啤酒廢水培養(yǎng)生物絮凝劑產(chǎn)生菌的研究[J].應(yīng)用化工，2009，11：1564-1567.

[5]毛艷麗，朱 濤，裴中芳，等.利用糖蜜廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑及條件優(yōu)化和效果實(shí)驗(yàn)研究[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2010，（1）：86-90.

[6]林俊岳，曾建忠，羅劍欽，等.利用糯米淀粉廢水制備微生物絮凝劑研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（6）：3090-3091，3111.

[7]吳大付，李東方，任秀娟，等.微生物絮凝劑的生產(chǎn)工藝及絮凝效果研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（1）：88-91.

[8]張艷君，張志強(qiáng)，戴曉睛，等.微生物絮凝劑廉價(jià)制備的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（1）：434-436.

[9]劉 暉，周康群，胡勇有，等.青霉菌HHE-P7利用醬油廢水產(chǎn)生微生物絮凝劑的研究[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2006，7（3）：40-44.

[10]陳于思，黃翔峰.醬油廢水處理方法及其研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊，2008，27（5）：70-75.

[11]楊 華，趙 勇，張 濱，等.紅平紅球菌發(fā)酵產(chǎn)生絮凝劑的條件優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，（6）：43-45.

[12]張 濱，馬美湖，楊 華.紅平紅球菌產(chǎn)微生物絮凝劑的發(fā)酵條件及分離純化[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，（5）：637-640.

[13]王曙光，劉賢偉，高寶玉，等.利用醬油釀造廢水生產(chǎn)微生物絮凝劑及其性能研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2006，12（4）：574-576.