劉永惠 郭少賢 常 靖 李 安 夏欣欣 王 瑞 華 莎

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(西安 710061)

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與突變型 P53基因和 mdm2基因關(guān)系密切,突變型 P53基因和 mdm2基因是腫瘤的相關(guān)基因?，F(xiàn)代中醫(yī)研究認(rèn)為,腫瘤及其轉(zhuǎn)移存在血瘀證,血瘀證與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)關(guān)系[1]。為深入研究血瘀證與活血化瘀藥物抗癌的作用機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)通過檢測丹參酮干預(yù)血瘀證裸鼠 P53、mdm2的表達(dá),探討其抗腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理。

1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞系 雌性裸鼠 40只,5周齡,體重 (20± 1)g,來自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司 ,許可證號碼 SCXK(滬 2007-0005),實(shí)驗(yàn)和飼養(yǎng)均在 SPF條件下進(jìn)行。乳腺癌細(xì)胞株 MDA-M B-231s購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 丹參酮注射液購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 (批號 90527CY)。腎上腺素購自上海禾豐制藥有限公司(批號 H31021062)。

1.3 主要儀器與試劑 SCW-BCM生物超凈工作臺購自蘇州市長春電子儀器廠,MDF-U72V超低溫冰箱購自日本三洋公司,臺式多功能離心機(jī)購自長沙市鑫奧儀器儀表有限公司,普通光學(xué)顯微鏡購自日本 Olympus公司,電熱恒溫水浴箱DR-HW-2購自北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠,CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上?？亓饪萍加邢薰?旋渦混合器購自上海第三分析儀器廠,胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,P53 Elisa試劑盒購自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate分裝,MdM 2 Elisa試劑盒購自 Groundwork Biotechnology Diagnosticate分裝。

1.4 方 法 1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌細(xì)胞系 MDAM B-231s在 10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),待細(xì)胞長至瓶底 80～90%,用 0.25%胰蛋白酶消化,3～5d傳代一次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行接種。

1.4.2 血瘀模型:將雌性裸鼠隨機(jī)分 2大組,分別為血瘀組、空白組。空白組 10只,連續(xù) 7d每只裸鼠皮下注射 0.2mL生理鹽水。血瘀組 30只,連續(xù) 7d每只裸鼠皮下注射 0.01%腎上腺素 0.2mL[2]。

1.4.3 測定指標(biāo)與方法:血瘀組中隨機(jī)選取 10只裸鼠和空白組 10只裸鼠,均采用摘除眼球取血法。由于裸鼠的血量較少且標(biāo)本量不得低于 4mL,所以把同一組 2只裸鼠的血樣合并為 1個樣本 ,每組 5個樣本 ,取血后立即用肝素抗凝,送至西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行測定。在血液流變儀上,切變率為 1s-1、5s-1、30s-1、200s-1測定全血黏度。

1.4.4 接種與給藥:將血瘀組余下的 20只裸鼠,隨機(jī)分為血瘀加瘤組和丹參酮組,每組 10只。將已培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞 M DA-MB-231s細(xì)胞懸液 0.2mL(1×10 7個)接種于裸鼠背部的外上方皮下。給藥計量采用人與動物計量換算法確定。①血瘀加瘤組:每天生理鹽水 0.2mL灌胃,連續(xù)給藥 14d。②丹參酮組:丹參酮給予 2mgㄍkg灌胃,連續(xù)給藥 14d。

1.4.5 蛋白酶聯(lián)免疫檢測 (ELISA)P53、mdm2,第 15天,每只裸鼠眼球采血 2mL,靜置 20min,然后 3000轉(zhuǎn)/分離心20min,仔細(xì)收集上清,貯存在-20℃冰箱中待檢。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒使用說明書操作 ,分別檢測裸鼠血清 P53、mdm2蛋白的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間數(shù)據(jù)的比較采用 t檢驗(yàn)。 P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 血液流變學(xué) 血液流變學(xué)檢測結(jié)果見表1。

表1 血液流變學(xué)結(jié)果(±s)

表1 血液流變學(xué)結(jié)果(±s)

指標(biāo) 空白組 血瘀組1S-1 28.43± 7.28 45.35± 10.56 5S-1 8.76± 2.31 13.54± 3.24 30S-1 3.53± 1.23 5.11± 3.36 200S-1 2.19± 1.24 3.99± 1.57

經(jīng) t檢驗(yàn)后,認(rèn)為空白組與血瘀組在 1S-1、5S-1、30S-1、200S-1四個指標(biāo)間差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),可以認(rèn)為兩組的全血黏度有差異。

2.2 P53、mdm2在血瘀加瘤組、丹參酮組中的表達(dá)情況

檢測 P53、mdm2在血瘀加瘤組、丹參酮組中的表達(dá)情況見表2。

表2 P53和 mdm2檢測結(jié)果(±s)

表2 P53和 mdm2檢測結(jié)果(±s)

指標(biāo) 血瘀加瘤組(ug/ml) 丹參酮組(ug/ml)P53 27.5213± 1.80803 19.0113± 1.06372 Mdm2 11.5725± 0.94633 5.6913± 1.30987

經(jīng) t檢驗(yàn)后,認(rèn)為丹參酮組與血瘀加瘤組比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),可認(rèn)為兩組有差異。

3 討 論 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率較高,并出現(xiàn)逐年上升、發(fā)病年齡年輕化的趨勢。據(jù)統(tǒng)計,每年新增乳腺癌的患者已超過 100萬[3],近年來,在我國乳腺癌已成為婦女惡性腫瘤第一位[4]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為乳腺癌為“乳巖”、“乳石癰”、“妒乳”。血脈瘀阻是其發(fā)病的主要機(jī)制 ,又是其形成的病理結(jié)果。臨床以病理性腫塊、疼痛、舌質(zhì)青紫為特點(diǎn)[5],正如《圣濟(jì)總錄》指出“瘤之為義,留滯而不去也。氣血流行不失其常,則形體和平;或余贅及郁結(jié)壅塞,則乘虛投隙,瘤所以生?！毖芯勘砻髂I上腺素多次小劑量皮下注射模擬長期肝氣不疏,氣滯不能行血,導(dǎo)致裸鼠全血黏度增高,血液處于黏、稠狀態(tài) ,形成血瘀證[2]當(dāng)血漿黏度增高時,血流速度隨之減緩,血流中的腫瘤細(xì)胞由于其體積較小,根據(jù)流體力學(xué)的原理,體積較小的腫瘤細(xì)胞就從血管軸心處向血管壁移動而易于附著血管壁不規(guī)則的地方,或附著于貼壁血栓上,或進(jìn)入停滯于血管壁的湍流區(qū)內(nèi)而使轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞得以著床,有利于腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。腫瘤形成后加劇了血脈瘀阻。血瘀證與腫瘤生長轉(zhuǎn)移存在正相關(guān)關(guān)系。

野生型 P53基因是一個重要的抑癌基因,位于 17號染色體短臂 1區(qū) 3.1帶 (17pl3.1)上,由 11個外顯子、10個內(nèi)含子組成,編碼 393個氨基酸組成的 53KD的核內(nèi)磷酸化蛋白。野生型 P53蛋白極不穩(wěn)定,半衰期非常短,大約 20min左右 ,具有反式激活功能和廣譜的腫瘤抑制作用。但野生型 P53基因卻是人類腫瘤發(fā)生最常見的突變基因之一。近 50%的人類腫瘤發(fā)現(xiàn)有 P53突變,人類乳腺癌中 P53的突變率為 50%～70%。其突變方式有點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變、移碼突變等。突變型P53基因編碼的 P53蛋白的半衰期可達(dá)數(shù)小時之久,突變體能夠與野生型蛋白形成異四聚體。異四聚體的構(gòu)象使它們處于顯性抑制狀態(tài),即結(jié)構(gòu)正常卻失去野生型 P53蛋白的正常功能,失去了細(xì)胞周期監(jiān)控器,引起細(xì)胞的增殖,最終會導(dǎo)致細(xì)胞癌變;并且可以抑制 P53的降解,導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)突變蛋白的積聚。一些分裂增殖的腫瘤細(xì)胞,可逃避免疫攻擊向周邊浸潤,進(jìn)入血液循環(huán),并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,積聚的 P53蛋白可隨腫瘤細(xì)胞的自溶或胞吐作用釋放到胞外,進(jìn)入血液循環(huán)。故認(rèn)為 P53可以作為腫瘤的一種特異性標(biāo)志物應(yīng)用于疾病的早期診斷和預(yù)后評估中。

mdm2基因即小鼠雙微體基因,是一種原癌基因 ,位于 12號染色體長臂 (12q13～14)上,編碼 491個氨基酸組成的核內(nèi)酸性蛋白質(zhì),對細(xì)胞生長具有調(diào)節(jié)作用,具有延長細(xì)胞生存期、促細(xì)胞增生的作用。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),mdm2在體內(nèi)是通過調(diào)節(jié) P53的穩(wěn)定性而影響細(xì)胞的狀態(tài),這兩者之間存在著一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)即 mdm2-P53負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)[6],它與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。 P53-mdm2負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán) ,在正常狀態(tài)下,mdm2抑制野生型 P53激活轉(zhuǎn)錄作用且介導(dǎo) P53降解;mdm2的表達(dá)又受野生型 P53的調(diào)節(jié),這對于維持正常細(xì)胞的生長有重要意義,是機(jī)體維持正常生理功能所必須的調(diào)節(jié)機(jī)制[7]。可一但 P53和 mdm2出現(xiàn)異常表達(dá) ,mdm2表達(dá)過強(qiáng)可封閉 P53介導(dǎo)的反式激活作用,使 P53功能喪失,細(xì)胞周期發(fā)生紊亂,致使細(xì)胞異常的增多,產(chǎn)生瘤體[8]。

活血化瘀藥物丹參等在我們既往臨床與實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)有抗腫瘤的作用[9],并對腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境也有重要的改善作用[10]。本實(shí)驗(yàn)選取丹參的提取物丹參酮,干預(yù)乳腺癌突變型P53基因、mdm2基因的表達(dá),經(jīng)蛋白酶聯(lián)免疫法檢測發(fā)現(xiàn)丹參酮能有效的抑制突變型 P53和 mdm2的表達(dá)。這說明丹參酮可以降低血液粘度,改善微循環(huán)[11],緩解血瘀證狀態(tài),有利于機(jī)體發(fā)揮免疫監(jiān)視作用,并且通過拮抗突變作用,可以降低突變型P53和 mdm2表達(dá),從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。目前丹參酮能抑制腫瘤的突變型 P53基因、mdm2基因的表達(dá)文獻(xiàn)報道較少,故本研究結(jié)論揭示血瘀證與腫瘤的突變型 P53基因、mdm2基因存在著密切關(guān)系,同時證實(shí)丹參酮在抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移中具有重要作用。

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