聶會(huì)生 李 芳 劉 珍 陳 萍 杜慶堂 陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

特靈膠囊由黃芩、牛黃、柴胡、板藍(lán)根、對(duì)乙酰氨基酚等組成的中西藥復(fù)方制劑,具有清熱解毒,清肺止咳之功效,用于感冒初期引起的咳嗽,流清涕,頭痛目眩等癥[1]。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量,參照有關(guān)文獻(xiàn)[2-5],本實(shí)驗(yàn)采用了 TLC法對(duì)制劑中的黃芩、牛黃、川貝、乙酰氨基酚和馬來(lái)酸氯苯那敏進(jìn)行了定性鑒別,采用 RP-HPLC法對(duì)制劑中黃芩的主要有效成分黃芩苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器與材料 KQ-2500超聲清洗儀(昆山檢測(cè)儀器廠);UV-8三用紫外分析儀(無(wú)錫科達(dá)儀器廠);939薄層制板器(重慶市南岸貝爾德儀器技術(shù)廠);101A-2型干燥器 (上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠);GalaxyTM 160D十萬(wàn)分之一及 Galaxy110型萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó) OHAUS公司);美國(guó) Watets公司高效液相色譜儀:510型高效液相泵,490E型紫外檢測(cè)器,U6K進(jìn)樣閥,820色譜數(shù)據(jù)工作站,TCM柱溫控制器,MILLIPORE溶劑過(guò)濾器;微量注射器 (10 μL,20 μL);Phenomenex C18(250mm× 4.6mm,5 μ m)色譜柱;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。黃芩對(duì)照藥材(批號(hào) 120955-200607,供鑒別用);黃芩苷(批號(hào) 110715-200815,供含量測(cè)定用);川貝母對(duì)照藥材(批號(hào) 121000-200806,供鑒別用);西貝堿對(duì)照品(批號(hào) 0714-9903,供含量測(cè)定用);膽酸(批號(hào) 100078-200414,供含量測(cè)定用);去氧膽酸(批號(hào)110724-200207,供鑒別用)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。 感特靈膠囊(自制,批號(hào) 110301、110302、110303)。

硅膠 G(薄層層析用,化學(xué)純)購(gòu)自青島海洋化工廠;色譜用水均為超純水,由 D7428超純水儀(Barnstead產(chǎn)品)制備;甲醇為色譜純?nèi)軇?(德國(guó)MERCK),其它試劑均為分析純(購(gòu)自西安化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果 2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芩的薄層鑒別:取本品內(nèi)容物 4g,研細(xì),加甲醇 50m L,超聲處理 30min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)蛹状?1mL使溶解,作為供試品溶液。同時(shí),按本品的制備工藝,制得不含黃芩的制劑,同供試品溶液的處理方法,制成黃芩的陰性對(duì)照溶液。另取黃芩對(duì)照藥材1g,同法制成對(duì)照藥材溶液。再取黃芩苷對(duì)照品,加甲醇制成每 1mL含 1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典 2010年版一部附錄 VI B)試驗(yàn),吸取上述 4種溶液各 2～4 μL,分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑的硅膠 G薄層板上,以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水 (5:3:1:1)為展開(kāi)劑,預(yù)平衡 30min,展開(kāi),取出,晾開(kāi),噴以 1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn);在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯一相同的暗綠色斑點(diǎn),且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.2 牛黃的薄層鑒別:取本品內(nèi)容物 0.5g,研細(xì),加氯仿 20m L,超聲處理 30min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)右掖?1mL使溶解,作為供試品溶液。同時(shí),按本品的制備工藝,制得不含牛黃的制劑,同供試品溶液的處理方法,制成牛黃的陰性對(duì)照溶液。另取膽酸、去氧膽酸對(duì)照品,加乙醇制成每 1mL各含 2mg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典 2010年版一部附錄 VI B)試驗(yàn),吸取上述 3種溶液各 2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上,以異辛烷-醋酸乙酯-冰醋酸 (15:7:5)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以 10%硫酸乙醇溶液,在 105℃烘約 5min,置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.3 川貝的薄層鑒別:取本品內(nèi)容物 10g,研細(xì),加濃氨試液 2mL與三氯甲烷 50mL,振搖,放置過(guò)夜,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)尤燃淄?1mL使溶解,作為供試品溶液。同時(shí),按本品的制備工藝,制得不含川貝母的制劑,同供試品溶液的處理方法,制成川貝母的陰性對(duì)照溶液。另取川貝母對(duì)照藥材 5g,同法制成對(duì)照藥材溶液。再取西貝堿對(duì)照品,加三氯甲烷制成每 1mL含0.5mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典 2010年版一部附錄 VI B)試驗(yàn),吸取上述 4種溶液各 4 μ L,分別點(diǎn)于同一以 0.6%羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠 G薄層板上,以三氯甲烷—甲醇—濃氨(8:2:0.2)的溶液為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中,在與藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的紅色斑點(diǎn);在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的紅色斑點(diǎn),且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

2.1.4 對(duì)乙酰氨基酚馬來(lái)酸氯苯那敏的薄層鑒別:取本品內(nèi)容物適量(約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚 0.2g),研細(xì),加三氯甲烷 20mL,振搖,濾過(guò),取濾液作為供試品溶液。另取對(duì)乙酰氨基酚與馬來(lái)酸氯苯那敏對(duì)照品,加三氯甲烷制成每 1mL中含對(duì)乙酰氨基酚10mg與馬來(lái)酸氯苯那敏 0.15mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典 2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn),吸取上述兩種溶液各 5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇(6:4)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,置碘蒸氣中使顯色。供試品色譜中,分別在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 含量測(cè)定 2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn):色譜柱:Phenomenex C18柱 (250mm× 4.6mm,5 μ m);流動(dòng)相:甲醇 -水 -冰醋酸 (44∶ 55∶ 1);檢測(cè)波長(zhǎng)為 277nm;流速為 1.0mL? min-1;柱溫為 30± 0.5℃;進(jìn)樣量為 10 μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備:取黃芩苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每 1m L含 0.02mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備:取本品內(nèi)容物,研細(xì),取約 0.3g,精密稱定,置 100mL量瓶中,加甲醇適量,超聲提取 30min,取出,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,精密吸取 1mL,置 10mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過(guò),作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照品溶液的制備:取缺黃芩的陰性對(duì)照樣品,同供試品溶液的制備方法,制備成陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 干擾試驗(yàn):照 2.2.1項(xiàng)下色譜條件,吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各 10 μL,分別依次進(jìn)樣。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,有色譜峰出現(xiàn),而陰性對(duì)照液在黃芩苷色譜峰位置處無(wú)相應(yīng)峰出現(xiàn),表明陰性無(wú)干擾。 (見(jiàn)圖 1)

圖1 黃芩苷對(duì)照品及樣品色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察:精密稱取黃芩苷對(duì)照品5.1mg,加甲醇制成 1mL含 0.0255mg的黃芩苷對(duì)照品溶液 ,分別取對(duì)照品溶液 2、4、8、12、16、20 μL,依次測(cè)定峰面積,以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=2E+08X+1E+06,r=0.9995。表明,黃芩苷在 0.051～0.510 μ g范圍內(nèi),峰面積值與進(jìn)樣量(μ g)有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn):精密吸取供試品溶液(批號(hào)110301),重復(fù)進(jìn)樣 6次 ,每次 10 μL,按 2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄黃芩苷峰面積積分值,RSD為 0.73%(n=6)。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試液(批號(hào)110301),分別在 0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣 ,測(cè)得樣品中黃芩苷峰面積值,結(jié)果 RSD=0.95%,說(shuō)明溶液中黃芩苷在 10h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn):按擬定的含量測(cè)定方法,以同一批樣品(批號(hào) 110301)分別制備 6份供試品溶液,測(cè)得峰面積,計(jì)算含量。黃芩苷含量(mg?粒-1)的RSD為 1.82%(n=6)。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn):取已知含量的樣品(黃芩苷含量:12.04mg/粒)6份,每份 0.15g,精密稱定,分別加入濃度為 1.0032 mg? mL-1的黃芩苷對(duì)照品溶液6mL、6m L、6mL、6mL、6mL、6mL,按 2.2.3項(xiàng)下操作,依法制備,進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,按下列公式計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 含量測(cè)定:取感特靈膠囊三批樣品,按2.2.3項(xiàng)下操作制備供試品溶液,按 2.2.1項(xiàng)下色譜條件,依法測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 感特靈膠囊中黃芩苷的含量測(cè)定

3 討 論 3.1 黃芩是本制劑中的主要藥材之一 黃芩苷是黃芩的主要活性成分,為本制劑的主要有效成分之一,因此選擇黃芩苷作為含量測(cè)定指標(biāo)成分較為合理,以達(dá)到控制制劑質(zhì)量,保證臨床療效的目的。

3.2 含量測(cè)定供試品溶液處理方法考察 試驗(yàn)中對(duì)供試品超聲提取的時(shí)間進(jìn)行了考察,超聲提取30min以后,樣品中黃芩苷的含量趨于穩(wěn)定,為節(jié)省時(shí)間,節(jié)約能源,所以確定超聲提取時(shí)間為 30min。

[1]衛(wèi)生部.中藥成方制劑 (第十三冊(cè) )[M].藥品標(biāo)準(zhǔn),WS3-B-2634-97.

[2]蘭 勇.高效液相色譜法測(cè)定病毒清顆粒中黃芩苷含量 [J].中國(guó)藥業(yè),2010,19(7):23-24.

[3]胡壽榮.高效液相色譜法測(cè)定安胎丸中黃芩苷的含量 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志 ,2010,16(4):66-67.

[4]胡 佳,錢立立.HPLC法測(cè)定一清顆粒中黃芩苷的含量 [J].黑龍江醫(yī)藥 ,2010,23(1):10-11.

[5]姚麗佳,冉海琳.反相高效液相色譜法測(cè)定防風(fēng)通圣丸中黃芩苷含量[J].中國(guó)藥業(yè),2010,19(4):21-22.