鐘健強(qiáng) 郭建軍 盧 奎 沈慶煜，

1.廣東省增城市人民醫(yī)院神經(jīng)科，廣東增城 511300；2.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科，廣東廣州510120

隨著我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)的到來(lái)，帕金森病這一常見(jiàn)老年神經(jīng)退行性疾病越來(lái)越受到研究者重視。近年來(lái)，眾多研究報(bào)道小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）的激活參與中樞黑質(zhì)紋狀體炎癥過(guò)程，從而加重帕金森病多巴胺能神經(jīng)元的變性凋亡過(guò)程[1]。通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)而控制其后續(xù)的炎癥反應(yīng)成為近年來(lái)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的研究熱點(diǎn)。小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞組織中顯示出強(qiáng)大的固有免疫功能，但其后續(xù)無(wú)控制的神經(jīng)炎癥在很多神經(jīng)退行性疾病的損傷機(jī)制中起著推動(dòng)作用。同樣，MG的激活在帕金森氏病的神經(jīng)元損傷中也存在類似的毒性效應(yīng)，從而加重黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺神經(jīng)元變性。米諾環(huán)素（minocycline）屬于四環(huán)素家族的廣譜、二代半合成脂溶性抗生素。研究報(bào)道，米諾環(huán)素能有效抑制LPS刺激的MG激活，從而下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β和NO的表達(dá)[2]。筆者設(shè)想，米諾環(huán)素能通過(guò)抑制MG激活引發(fā)的炎癥反應(yīng)從而減輕對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷。PC12細(xì)胞的生物學(xué)特性類似于多巴胺能神經(jīng)元，常作為帕金森病的離體研究模型。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)米諾環(huán)素對(duì)LPS刺激后的小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2激活進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)而觀察干預(yù)BV2細(xì)胞對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響，探討米諾環(huán)素在MG對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)影響中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑耗材

細(xì)胞培養(yǎng)所需的DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰酶均購(gòu)于GIBICO公司。LPS（L2880）、米諾環(huán)素（M9511）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）預(yù)包被試劑盒小鼠源TNF-α、IL-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)于深圳達(dá)科為生物公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)于MBchem公司。6、96孔transwell共培養(yǎng)板購(gòu)于corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和共培養(yǎng) 多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系PC12以及小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心。PC12細(xì)胞、BV2細(xì)胞的培養(yǎng)基均為含10%胎牛血清（FBS）的DMEM-F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基均已加入雙抗（靑、鏈霉素），細(xì)胞置于5% CO2，37℃的細(xì)胞溫箱培養(yǎng)。兩種細(xì)胞均為貼壁生長(zhǎng)，3～5 d傳代1次。將BV2細(xì)胞接種于6孔（2×105cells/孔）、24孔（1×104cells/孔）和 96孔 transwell（5×103cells/孔）共培養(yǎng)板的上層板中，按如下因素進(jìn)行BV2細(xì)胞分組：CON組，LPS組，LPS+MINO組。CON組：BV2細(xì)胞不加任何干預(yù)因素作為對(duì)照組；LPS組：BV2細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入LPS至終濃度為3 ng/mL，刺激約30 min后換掉含有LPS的培養(yǎng)液，清洗3遍；LPS+MINO組：BV2細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入LPS（同上組），在加LPS的同時(shí)加入米諾環(huán)素（終濃度至60 μmol/L）。將PC12細(xì)胞分別接種于6孔和96孔Transwell共培養(yǎng)板的下層板中，接種密度與對(duì)應(yīng)BV2細(xì)胞相同，上下層板之間為半透膜，允許水分和中等大小的蛋白自由通過(guò)，使上下層細(xì)胞實(shí)現(xiàn)共培養(yǎng)。共培養(yǎng)24 h后，取各組上清液及下層板的PC12細(xì)胞做下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ELISA法 檢 測(cè) TNF-α、IL-1β 表 達(dá) 6孔 Transwell共培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)各組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別提取各組上層板BV2細(xì)胞的上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定TNF-α、IL-1β的濃度。步驟嚴(yán)格按照廠商提供的說(shuō)明書操作，最后在595 nm波長(zhǎng)讀取OD值，輸入標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出TNF-α、IL-1β的濃度。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率 各組生長(zhǎng)有PC12細(xì)胞的96孔板下板，予200 μL/孔更換培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)與試驗(yàn)孔平行的本底對(duì)照孔，比色時(shí)以本底對(duì)照孔調(diào)零。每孔加入20 μL MTT至終濃度濃度0.5 mg/mL，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振蕩儀振蕩10 min，至紫色晶體顆粒充分溶解，酶標(biāo)儀檢測(cè)595 nm的OD值。細(xì)胞存活率=加藥組A值/溶劑對(duì)照組A值×100%，并以6個(gè)復(fù)孔的平均值作為單個(gè)數(shù)據(jù)計(jì)算存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（± s）表示，多組資料間的比較采用單因素方差分析，處理組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 共培養(yǎng)體系各組炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達(dá)水平

通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定共培養(yǎng)體系的炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)水平見(jiàn)圖1。共培養(yǎng)24 h后，LPS刺激MG后細(xì)胞外釋放的TNF-α和IL-1β明顯升高，在米諾環(huán)素干預(yù)后有所降低。與CON組比較，*P ＜0.01；與LPS組比較，#P ＜ 0.01。

圖1 各組共培養(yǎng)液TNF-α、IL-1β表達(dá)量示意圖

2.2 共培養(yǎng)體系各組PC12細(xì)胞存活率比較

對(duì)各組MTT檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，各組間細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=58.64，P ＜0.01）。LPS組細(xì)胞存活率（43.58±1.87）%低于CON組（P ＜0.01）；LPS組細(xì)胞存活率（71.13±2.52）%高于LPS組（P ＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率（x ± s）

3 討論

帕金森病是常見(jiàn)的老年中樞神經(jīng)變性疾病，其病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性丟失，紋狀體區(qū)多巴胺水平下降，剩余的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)形成以α-突觸共核蛋白（α-syn）為主的嗜酸性包涵體-路易氏小體（LB）[3]。近年來(lái)，很多研究表明免疫/炎性機(jī)制參與到帕金森病的發(fā)病機(jī)制中。Orr等[4]發(fā)現(xiàn)中樞黑質(zhì)存在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及炎癥因子的表達(dá)，由此推斷帕金森病的發(fā)生發(fā)展可能與小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活引發(fā)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。MG激活還能通過(guò)氧化應(yīng)激促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡[5]。MG在腦組織中顯示出強(qiáng)大的固有免疫功能，但其在免疫應(yīng)答中釋放出來(lái)的炎性因子嚴(yán)重的影響了神經(jīng)元的活動(dòng)及其信息處理能力[6]。

帕金森病傳統(tǒng)的治療方式大多為恢復(fù)中樞多巴胺遞質(zhì)水平，但亦不能阻止多巴胺能神經(jīng)元的持續(xù)變性損害。抑制MG激活進(jìn)而下調(diào)其黑質(zhì)區(qū)后續(xù)的炎癥反應(yīng)成為治療PD的一條新思路。米諾環(huán)素是第2代四環(huán)素類抗生素，并且是一種潛在的腦損傷神經(jīng)保護(hù)劑，它很好的通過(guò)血腦屏障達(dá)到臨床有效治療濃度。米諾環(huán)素可以抑制γ-干擾素誘導(dǎo)的蛋白激酶磷酸化，進(jìn)而抑制干擾素調(diào)節(jié)因子-1（IRF-1）基因易位而導(dǎo)致的Ⅱ類抗原反式激活因子（CIITA）增高，下調(diào)MHC-II導(dǎo)致靜息狀態(tài)MG的抗原呈遞減少，最終降低MG的激活程度[7]。Filipovic等[8]研究表明米諾環(huán)素可以減少M(fèi)G激活所致的神經(jīng)元損傷以及降低BCL-2家族蛋白丟失轉(zhuǎn)移所致的細(xì)胞凋亡率。但是，米諾環(huán)素能否用于調(diào)控黑質(zhì)區(qū)域MG激活，更進(jìn)一步抑制多巴胺能神經(jīng)元變性凋亡呢？米諾環(huán)素能通過(guò)對(duì)抗線粒體功能抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[9]，這說(shuō)明米諾環(huán)素對(duì)PC12細(xì)胞的有著直接的保護(hù)效應(yīng)，但是否通過(guò)MG介導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采納BV2與PC12共培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)MG和多巴胺能神經(jīng)元的相互作用，并用經(jīng)典的LPS刺激MG激活。共培養(yǎng)后，上清液中檢測(cè)到TNF-α、IL-1β較未刺激的對(duì)照組明顯升高。既往研究證實(shí)，TNF-α基因沉默小鼠可一定程度對(duì)抗MPTP毒性，說(shuō)明TNF-α可協(xié)同MPTP對(duì)中樞多巴胺能神經(jīng)元的毒性[10]。眾多研究表明，IL-1β在帕金森病發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[11]。運(yùn)用米諾環(huán)素抑制MG激活后，觀察到后續(xù)的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β表達(dá)下降。炎癥表達(dá)的下調(diào)直接降低了PC12細(xì)胞的凋亡，增加了其存活率，這證實(shí)了米諾環(huán)素可能通過(guò)抑制MG激活而下調(diào)TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)，從而保護(hù)PC12細(xì)胞，降低凋亡的發(fā)生率，促進(jìn)中樞多巴胺/乙酰膽堿遞質(zhì)平衡。

綜上所述，米諾環(huán)素抑制MG激活可下調(diào)其炎癥表達(dá)，該效應(yīng)可降低PC12細(xì)胞的凋亡發(fā)生，并提高其存活率，這對(duì)PD患者的治療來(lái)說(shuō)無(wú)疑是一種可嘗試的新途徑。但是，MG的激活是由多種外界因素以及內(nèi)環(huán)境所導(dǎo)致的，調(diào)控PD的MG激活是否發(fā)揮主要治療作用，是否存在更多的聯(lián)合干預(yù)機(jī)制，這有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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