安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 陳佳佳 王在貴＊ 劉朝良 張 璐 方龍發(fā)

荷葉甘、平、無(wú)毒，具有消暑、清肺等作用（劉嵩，2006）。研究表明，荷葉中有效成分含量豐富，除含有碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)等常規(guī)化學(xué)成分外，還富含具有生物活性和生理功能的黃酮類化合物（宛曉春，2003）。它是大多數(shù)氧自由基的清除劑，可以提高SOD（超氧化物歧化酶）的活力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（MDA）及氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的生成（張蕾，2007；唐裕芳等，2004；余以剛等，2001），防治心血管疾病等作用（陳健芬等，2003；黃阿根等，2000）。此外荷葉黃酮還具有很強(qiáng)的降脂、減肥等功效，除可作為心血管疾病防治的原料藥，還可廣泛應(yīng)用于功能性食品、保健食品和飲料中，目前已經(jīng)被中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部列入藥食同源的名單（陶波等，2001）。

由于荷葉黃酮具有多種功能而越來(lái)越受到廣大學(xué)者的關(guān)注。大孔吸附樹脂柱色譜應(yīng)用于荷葉黃酮的分離純化具有加工成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單、節(jié)約能耗、可再生能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為廣大研究與生產(chǎn)廠家的首選材料（唐德智，2009；肖文軍等，2007）。本試驗(yàn)以荷葉為原料，對(duì)幾種大孔吸附樹脂分離荷葉黃酮技術(shù)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，獲得荷葉黃酮柱分離純化的參數(shù)，為荷葉黃酮的研究與工業(yè)化開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 荷葉干品（購(gòu)自合肥為民大藥房 ），X6、HP-20、AB-8、HPD-100、 無(wú) 水 乙 醇 、NaOH均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 荷葉黃酮的提取 參照康璇等（2009）的方法，稱取荷葉15 g，用450 mL 60%的乙醇浸泡，80℃水浴，提取3 h，過(guò)濾，濾液濃縮蒸發(fā)至200 mL，冷卻，后離心得到荷葉初提物，測(cè)定其含量并用95%乙醇將其配置成3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2 樹脂的預(yù)處理 稱取20 g濕樹脂倒入燒杯，先用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇充分浸泡一夜，用乙醇洗數(shù)次至洗出液加適量水無(wú)白色渾濁，再用去離子水不斷沖洗直到無(wú)酒精味且洗出液澄清，然后轉(zhuǎn)入酸堿處理，即先用體積分?jǐn)?shù)5%的HCl溶液浸泡3 h再用去離子水洗滌數(shù)次直到pH呈7.0左右，用5%NaOH溶液浸泡3 h，最后用去離子水洗至pH值為7.0左右。

1.2.3 荷葉黃酮的純化

1.2.3.1 最佳吸附與解吸樹脂的選擇 本試驗(yàn)以上述荷葉黃酮標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照品測(cè)定幾種大孔吸附樹脂對(duì)黃酮的吸附效果。選用AB-8、HPD-100、HP-20及X-5樹脂按方法1.2進(jìn)行預(yù)處理。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的4種大孔樹脂去表面水后，各稱取2份，每份5.0 g，分2組放置于具塞磨口錐形瓶中，分別加入濃度為3.0 mg/mL的荷葉黃酮對(duì)照液40 mL，將三角瓶放在振蕩器上振蕩，使樹脂充分吸附黃酮24 h后過(guò)濾測(cè)定濾液中荷葉黃酮的含量，吸附了黃酮的樹脂加入95%乙醇40 mL，振蕩充分解吸24 h，得到解吸液，測(cè)定解吸液中黃酮的含量，計(jì)算靜態(tài)吸附量、解吸量與解吸率。1.2.3.2 HP-20樹脂對(duì)荷葉黃酮的動(dòng)態(tài)吸附效果研究 根據(jù)1.2.3.1的試驗(yàn)結(jié)果，選擇大孔吸附樹脂（HP-20）進(jìn)行上樣流速、上樣液濃度、pH、解吸曲線以及洗脫劑的濃度動(dòng)態(tài)吸附效果試驗(yàn)。先用緩沖液將樹脂調(diào)至pH 5.0后，利用漏斗將預(yù)處理好的樹脂裝入玻璃層析柱（1 cm×20 cm）中，柱床體積為（BV）10.0 mL。裝柱要讓樹脂隨著緩沖液慢慢沉下，柱床緊實(shí)無(wú)氣泡。利用恒流泵將黃酮提取液上柱，控制一定流速，收集所有流出液，測(cè)定其體積和濃度。

吸附量=上樣液濃度 （mg/mL）×上樣液體積（mL）－流出液濃度（mg/mL）×流出液體積（mL）；

使用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行解吸，控制一定流速，分步收集洗脫液（5 mL/管），測(cè)定每個(gè)收集管內(nèi)洗脫液的總黃酮含量，計(jì)算并繪制洗脫曲線。

解吸率=洗脫液體積 （mL）×洗脫液濃度（mg/mL）/吸附量。

2 結(jié)果分析

2.1 吸附樹脂的選擇 按方法1.2.3.1測(cè)定4種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附效果，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種大孔樹脂的靜態(tài)吸附效果

由表1可以看出，4種樹脂中X-5樹脂的吸附量最高，當(dāng)原液濃度為3 mg/mL時(shí)，吸附量為48.00 mg，但其解吸量?jī)H為 38.08 mg，解吸率為79.3%，而AB-8樹脂，解吸率為95.6%，解吸率最高，但是其吸附量只有32.08 mg，故這兩種樹脂效果相對(duì)較差。綜合比較可知，吸附與解吸效果相對(duì)較好的樹脂是HP-20，盡管其解吸率較AB-8樹脂低，但其吸附量較高，為45.84 mg，僅次于X-5樹脂，且其解吸量在4種樹脂中最高，為41.20 mg，因此選擇HP-20樹脂進(jìn)一步做動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)研究。

2.2 HP-20樹脂的動(dòng)態(tài)吸附效果

2.2.1 pH值的影響 用酸或堿將荷葉總黃酮提取液調(diào)至 pH 3.62、4.24、5.40，同時(shí)將樹脂調(diào)至相應(yīng)pH值后再上樣，測(cè)定吸附與解吸的黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，pH 4.24時(shí)，HP-20對(duì)荷葉總黃酮有較大的吸附量，故選擇在弱酸或酸性條件下進(jìn)行吸附。

表2 對(duì)吸附量及解吸率的影響

2.2.2 上樣液濃度的影響 將荷葉總黃酮的濃縮液加水分別稀釋成0.30、0.50 mg/mL和 0.70 mg/mL 3種濃度后分別上樣。結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明，上樣液濃度較低時(shí)，吸附量較小，隨濃度的增大，吸附量也增大，當(dāng)上樣液濃度達(dá)到0.70 mg/mL時(shí)，吸附量增加不明顯，上樣液濃度控制在0.50～0.70 mg/mL較合適。

2.2.3 流速的影響 利用恒流泵控制流速，分別以 0.70、1.50、2.3、3.1 mL/min 進(jìn)行上樣。 結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明，當(dāng)流速加到2.3 mL/min時(shí)，樹脂的吸附量明顯下降，流速過(guò)慢時(shí)，雖然吸附量增加，但導(dǎo)致循環(huán)周期延長(zhǎng)。因此，控制在1.50 mL/min較理想。

2.2.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的選擇 以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每次收集40 mL的洗脫液，將洗脫液混勻后測(cè)得其中的總黃酮含量，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，洗脫效果越好，當(dāng)用體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%以上的乙醇水溶液洗脫時(shí)，已經(jīng)可以有很好的洗脫效果。

2.2.5 HP-20樹脂的解吸曲線 準(zhǔn)確稱取荷葉黃酮對(duì)照品配成1.0 mg/mL的溶液，10 mL樹脂處理25 mL（1.0 mg/mL）的料液，流速1.5 mL/min上樣，吸附后用蒸餾水洗后，再分別 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 BV 的 95%乙醇溶液洗脫， 測(cè)定每個(gè)流出液所洗脫下來(lái)的荷葉黃酮的含量，以洗脫液總體積對(duì)洗脫下來(lái)的荷葉黃酮的總量作洗脫曲線。結(jié)果見(jiàn)圖1，隨著乙醇洗脫體積的上升，黃酮的解吸量增加，當(dāng)洗脫體積小于2.5 BV時(shí)，洗脫量與洗脫體積呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)洗脫體積大于3 BV時(shí)，洗脫體積對(duì)洗脫量基本無(wú)影響，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，使用3 BV的洗脫液即可將荷葉黃酮較大部分洗脫下來(lái)。

圖1 HP-20樹脂的洗脫曲線

3 小結(jié)

通過(guò)以上試驗(yàn)，得到了大孔吸附樹脂HP-20對(duì)荷葉總黃酮的最佳吸附條件是提取液總黃酮含量為0.50～0.70 mg/mL，上樣流速為1.5 mL/min，提取原液最適pH為4.3左右，這是由于總黃酮化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因而可達(dá)到較好的吸附效果。在這些條件下，樹脂對(duì)荷葉總黃酮的吸附量可以達(dá)到5.20 mg/mL，通過(guò)使用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)越高的乙醇水溶液洗脫效果越好，當(dāng)用體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%的乙醇水溶液洗脫時(shí)，解吸率已經(jīng)達(dá)到了89.9%，洗脫效果已經(jīng)相對(duì)較好。大孔樹脂HP-20具有物理化學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)荷葉總黃酮吸附選擇性強(qiáng)，富集效果好，解吸條件溫和，且HP-20再生簡(jiǎn)便，使用周期長(zhǎng)，是一種理想的富集純化荷葉總黃酮的主材料。

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