竇 屾, 任文雅, 楊春霞, 于廣鑫, 徐 瑾, 廖永紅

大豆的營養(yǎng)價(jià)值很高,它含有40%左右的蛋白質(zhì)、多種維生素和礦物質(zhì),大豆蛋白經(jīng)水解生成很多具有生理活性的多肽,并且這些多肽被應(yīng)用到各種功能性食品和保健品中,廣受人們的親睞[1-3].制備大豆多肽的方法多為酶解法.文獻(xiàn)表明,單酶酶解大豆蛋白的水解度較低且反應(yīng)的時(shí)間長,雙酶復(fù)合酶解不僅可以提高水解度、縮短反應(yīng)時(shí)間而且能夠產(chǎn)生很多容易被人體消化和吸收的低分子肽[1,4-5].目前,多用堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶對大豆蛋白進(jìn)行酶解,這是由于它們的最適pH值和溫度都比較接近而且來源廣泛、價(jià)格較低、適合工業(yè)化生產(chǎn).大部分酶解大豆的相關(guān)研究都是以成本較高的大豆分離蛋白(SPI)或大豆?jié)饪s蛋白為底物(蛋白含量在70%以上),很少有以廉價(jià)全脂大豆粉作為直接反應(yīng)底物的.然而,考慮到這兩類底物中蛋白組成大體相同,并且全脂大豆粉比大豆分離蛋白成本低廉.因此,本研究采用堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶雙酶法水解全脂大豆粉,力求獲得具有較高水解度的酶解全脂大豆粉的方法.

1　材料與儀器

1.1　材料和試劑

全脂大豆粉,市場購得;堿性蛋白酶Alcalase(經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定酶活力為108 000 U/mL)、木瓜蛋白酶(經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定酶活力為85 600 U/mL),均購自Novozymes公司;其余試劑均為分析純.

1.2　主要儀器

DSHZ-300型多用途水浴恒溫振蕩器,江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;PHS-3C型pH計(jì),成都世紀(jì)方舟科技儀器有限公司;電子分析天平;凱式定氮儀.

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　總氮含量的測定

取1 g全脂大豆粉應(yīng)用凱氏定氮法[6]測定其中氮含量.將全脂大豆粉充分研磨后置于稱量瓶中,放105℃烘箱內(nèi)烘烤1 h,每隔30 min稱重直到重量不變?yōu)橹?放入消化管中進(jìn)行充分的消化、蒸餾后用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定.樣品中蛋白質(zhì)含量按式(1)計(jì)算.

式(1)中,X為全脂大豆粉中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù),g/100 g;V1為試樣消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L;m為試樣質(zhì)量,g,本實(shí)驗(yàn)取1 g;F為氮轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)系數(shù),本實(shí)驗(yàn)中取5.71.

2.2　水解度的測定

應(yīng)用pH stat法[7],通過加堿來調(diào)整反應(yīng)過程中的pH值,使得蛋白酶始終在固定pH值下水解蛋白質(zhì),最后通過計(jì)算加堿量來計(jì)算水解度.水解度(DH)按式(2)計(jì)算.

式(2)中,B為酶解過程中所消耗的堿量,mL;Nb為堿液的濃度,mol/L;α為氨基的解離度;Mp酶解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量,g;htot為單位質(zhì)量原料蛋白質(zhì)肽鍵當(dāng)量數(shù),本實(shí)驗(yàn)中取7.21

α氨基的解離度可以由式(3)計(jì)算.

式(3)中,pH值為酶解時(shí)溶液的pH值;pK為NH3+的解離常數(shù),本實(shí)驗(yàn)取7.0.

2.3　全脂大豆粉酶解條件的確定

根據(jù)大豆蛋白水解的相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]以及反應(yīng)用酶的最適條件,選取底物濃度、pH值、溫度和酶濃度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),并依據(jù)文獻(xiàn)選取相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)水平.

2.3.1底物濃度對水解的影響實(shí)驗(yàn)

配制5份底物體積分?jǐn)?shù)分別為1%,2%,3%,4%,5%的溶液,在pH值、溫度和加酶量相同的條件下反應(yīng)240 min.反應(yīng)過程中持續(xù)加入NaOH溶液使得溶液的pH值保持恒定,按照2.2中方法測定DH值.

2.3.2pH值對水解的影響實(shí)驗(yàn)

配制5份底物濃度和加酶量相同的溶液,分別調(diào)節(jié)pH值到7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,在相同溫度下酶解240 min.按照2.2中方法測定溶液DH值.

2.3.3溫度對水解的影響實(shí)驗(yàn)

將底物濃度、加酶量和pH值都相同的溶液在45,50,55,60,65℃下酶解240 min,按照2.2中方法測定DH值.

2.3.4酶濃度對水解的影響實(shí)驗(yàn)

1)總加酶量的確定.向底物濃度和pH值相同的5份溶液加入復(fù)合酶(兩種酶活力比為1∶1)1 125,1 625,2 175,2 700,3 265 U/g,在相同溫度下反應(yīng)240 min.按照2.2中方法測定DH值.

2)復(fù)合酶比例的確定.按照復(fù)合酶酶活力比(堿性蛋白酶Alcalase與木瓜蛋白酶之比為1∶1,1∶2,2∶1,2∶3,3∶2)加入 2 700 U/g 的酶到底物濃度和pH值都相同的溶液中,在相同溫度下反應(yīng)240 min.按照2.2中方法測定DH值.

2.3.5酶解工藝的優(yōu)化

利用2.3.1至2.3.4得到的各個(gè)因素的最適范圍,對反應(yīng)溫度(A)、pH值(B)、底物體積分?jǐn)?shù)(C)和總加酶量(D)四個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),通過測定DH確定最佳的水解條件,因素水平表見表1.

表1　L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1　Factors and levels of L9(34)orthogonal experiment

2.4　酶解促進(jìn)劑添加條件的確定

根據(jù)文獻(xiàn)[1,7]選取對堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶活性都有明顯促進(jìn)作用的促進(jìn)劑Mn2+、Ca2+和半胱氨酸(Cys),應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)確定出最佳酶解促進(jìn)劑及最適濃度.

2.4.1促進(jìn)劑的篩選

配制4份底物溶液,一份為空白,其余3份溶液分別加入 MnCl2、CaCl2和 Cys使得 Mn2+、Ca2+和 Cys濃度達(dá)到4 mmol/L,在正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)酶解條件下反應(yīng)240 min,按照2.2中方法測定DH值.

2.4.2最佳促進(jìn)劑的濃度篩選

將MnCl2加入到5份底物溶液中,使得Mn2+的濃度分別為2,3,4,5,6 mmol/L,在正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)酶解條件下反應(yīng)240 min,按照2.2中方法測定DH值.

2.5　酶解時(shí)間的確定

按照正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件和最佳促進(jìn)劑的條件對底物溶液進(jìn)行酶解,反應(yīng)時(shí)間240 min.每隔30 min加入NaOH維持溶液pH值恒定,按照2.2中方法測定DH值.

3　結(jié)果與討論

3.1　全脂大豆粉中蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

按2.1中方法對市售全脂大豆粉中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定,測得其蛋白質(zhì)含量為32.13%,與文獻(xiàn)[1]中報(bào)道的大豆中蛋白質(zhì)含量一致.

3.2　單因素對水解的影響

3.2.1底物濃度對水解的影響

5份底物溶液在pH值為8.0,55℃下加入堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶酶活力比為1∶1的復(fù)合酶12 000 U,按照2.3.1方法進(jìn)行反應(yīng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1.

圖1　底物體積分?jǐn)?shù)對DH的影響Fig.1　Effect of substrate concentration on DH

由圖1可知,底物體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)DH值僅為8.3%,隨著底物體積分?jǐn)?shù)的升高,DH值亦隨之增加;底物體積分?jǐn)?shù)為4%時(shí),DH值達(dá)到最高為13.1%,比底物體積分?jǐn)?shù)1%高出4.8%.然而隨著底物濃度繼續(xù)增大,DH值反而減小.這種變化規(guī)律是由于底物較少的時(shí)候酶與底物結(jié)合生成酶反應(yīng)復(fù)合物較少,不利于反應(yīng)的進(jìn)行;隨著底物濃度的增加,酶可以充分和底物相接觸從而提高了反應(yīng)速率.但是底物濃度過高會(huì)使得底物的溶解性變差,出現(xiàn)互相聚合的現(xiàn)象阻止了酶與底物相接觸降低了反應(yīng)的速率.因此確定最佳底物濃度為4%.

3.2.2pH值對水解的影響

向配好的5份4%底物溶液中分別加入酶活力比為1∶1的雙酶2 700 U/g,在55℃下按照2.3.2中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2.

圖2　pH值對DH的影響Fig.2　Effect of pH on DH

由圖2可以看出,pH值為7.0時(shí)DH值為12.8%,隨著pH值的上升,DH值一直升高,在pH值為8.0時(shí),DH值達(dá)到最高為13.9%,而隨著pH值的繼續(xù)升高DH值反而下降,在pH值為9.0時(shí),DH值比pH值為7.0的低了3.7%.這是因?yàn)槊缸鳛橐环N具有催化作用的生物活性物質(zhì)與環(huán)境中的pH值密切相關(guān),pH值會(huì)影響酶分子的空間構(gòu)象和酶分子與底物結(jié)合的狀態(tài),從而影響酶促反應(yīng)的速率.因此確定反應(yīng)的最佳pH值為8.0.

3.2.3溫度對水解的影響

向底物體積分?jǐn)?shù)為4%的溶液中加入酶活力比為1∶1的雙酶2 700 U/g,溶液的初始pH值為8.0,按照2.3.3中方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3.

圖3　溫度對DH的影響Fig.3　Effect of temperature on DH

從圖3可以看出,DH值在一開始隨著溫度的上升而逐漸上升,在55℃時(shí)DH值達(dá)到最高為13.8%,比45℃時(shí)的DH值高出3.7%.而在55℃之后DH值卻隨著溫度的上升而逐漸下降,65℃時(shí)DH值僅為7.2%.這是由于溫度對酶解反應(yīng)的影響是非常大的,隨著溫度的上升酶促反應(yīng)的速率會(huì)跟著上升,但是在到達(dá)最適溫度之后繼續(xù)升溫會(huì)使得酶活損失加大,從而抑制酶與底物結(jié)合的能力,降低反應(yīng)速率.因此確定反應(yīng)的最適溫度為55℃.

3.2.4酶濃度對水解的影響

1)總加酶量對水解的影響.將底物體積分?jǐn)?shù)為4%、pH值為8.0的溶液在55℃下,按照2.3.4中1)進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果如圖4.

圖4　加酶量對DH的影響Fig.4　Effect of enzyme dosage on DH

從圖4中可以看出,隨著加酶量的增大,酶分子可以和更多的底物結(jié)合,酶促反應(yīng)的速率也在增大.不過當(dāng)DH值達(dá)到12.6%,即加酶量為2 700 U/g時(shí)反應(yīng)速率趨于平緩,DH值變化不大,3 265 U/g時(shí)的DH值僅比2 700 U/g時(shí)高出0.2%.所以,本次實(shí)驗(yàn)中最適總的加酶量為2 700 U/g.

2)堿性蛋白酶Alcalase與木瓜蛋白酶復(fù)合比例對水解的影響.將底物體積分?jǐn)?shù)為4%、pH值為8.0的溶液在55℃下,按照2.3.4中2)進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果見圖5.

圖5　復(fù)合酶酶活力比對DH的影響Fig.5　Effect of compound enzyme ratio on DH

從圖5中可以看出,復(fù)合酶活力比在堿性蛋白酶Alcalase與木瓜蛋白酶之比為2∶1時(shí)DH值最高,為14.4%,因此選取此比例作為最佳水解比例.在后續(xù)的正交試驗(yàn)中用此復(fù)合酶比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

3.3　復(fù)合酶水解全脂大豆粉的正交試驗(yàn)

按照2.3.5方法對全脂大豆粉酶解條件進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化,以DH為指標(biāo),利用極差分析確定各個(gè)因素水平的最佳組合.正交試驗(yàn)結(jié)果見表2.

通過極差分析可知,表2中各個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)的影響為A＞B＞C＞D,即溫度對DH的影響最大,酶的總濃度對于實(shí)驗(yàn)影響的最小.極差分析得到的最優(yōu)組合與直觀最優(yōu)組合不一致,前者是A3B3C3D3,后者為A3B2C1D3.將極差分析得到的最優(yōu)組合和直觀最優(yōu)組合做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)比較,表明極差分析最優(yōu)組合比直觀最優(yōu)組合酶解結(jié)果要好.即在溫度60℃、pH值 8.5、底物體積分?jǐn)?shù) 4.5%、總加酶量11 880 U的條件下全脂大豆粉DH值最高為16.3%.

表2　L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.2　Analysis of results of orthogonal experiment

3.4　酶解促進(jìn)劑對水解的影響

3.4.13種促進(jìn)劑的篩選

底物溶液在溫度60℃、pH值8.5、底物體積分?jǐn)?shù)4.5%、總加酶量11 880 U時(shí),按照2.4.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn),確定最佳酶解促進(jìn)劑.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6.

圖6　3種促進(jìn)劑對DH值的影響Fig.6 Effect of three accelerants on DH

從圖6中可以看出,Mn2+、Ca2+和 Cys對復(fù)合酶酶解全脂大豆粉都有促進(jìn)作用,其中Mn2+的促進(jìn)效果最明顯,DH值能達(dá)到17.4%.這可能是由于Mn2+能夠更好的激活酶分子中的催化基團(tuán)使得酶對底物的親和力更強(qiáng).

3.4.2Mn2+最佳濃度的篩選

溶液在溫度60℃、pH值8.5、底物體積分?jǐn)?shù)4.5%、總加酶量11 880 U時(shí),按照2.4.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn),確定Mn2+的濃度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7.

圖7　Mn2+濃度對DH值的影響Fig.7　Effect of the concentration of Mn2+on DH

從圖7中可以看出,Mn2+濃度在5 mmol/L的時(shí)候DH值達(dá)到最高,然后曲線趨于平穩(wěn).綜合考慮選擇5 mmol/L Mn2+為酶解全脂大豆粉促進(jìn)劑的最佳濃度.

3.5　酶解時(shí)間對水解的影響

將含有5 mmol/L Mn2+的溶液在溫度60℃、pH值8.5、底物體積分?jǐn)?shù)4.5%、總加酶量11 880 U的條件下,按照2.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn),確定最佳酶解促進(jìn)劑.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8.

圖8　酶解時(shí)間對DH值的影響Fig.8　Effect of enzymatic time on DH

從圖8中可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長DH值呈上升趨勢,在180 min時(shí)DH值達(dá)到17.8%,比最初的30 min高出7.5%,而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過180 min時(shí)DH值變化并不明顯,因此選擇180 min為酶解的最佳時(shí)間.

4　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用廉價(jià)全脂大豆粉做原料,利用堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶復(fù)合進(jìn)行酶解,得到了具有較高水解度的酶解工藝,使得全脂大豆粉能夠更好的應(yīng)用到多肽的工業(yè)化生產(chǎn)中.本實(shí)驗(yàn)的酶解全脂大豆粉最佳條件是底物體積分?jǐn)?shù)4.5%、pH值8.5、溫度60℃、復(fù)合酶加酶量(堿性蛋白酶Alcalase∶木瓜蛋白酶活力之比為2∶1)2 640 U/g、添加5 mmol/L Mn2+酶解180 min.與杜翠榮等[8]報(bào)道的堿性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶的酶解結(jié)果相比,本實(shí)驗(yàn)酶解時(shí)間比文獻(xiàn)中要短3h,DH值要高5%.然而與酶解大豆分離蛋白的文獻(xiàn)相比本實(shí)驗(yàn)的DH值較低,這可能因?yàn)槿蠖狗壑羞€有其他物質(zhì)如油脂、金屬元素、維生素等,這些物質(zhì)可能會(huì)對蛋白質(zhì)形成包裹進(jìn)而阻止酶與底物充分接觸,抑制DH值的升高.如果用本實(shí)驗(yàn)的酶解工藝酶解純度較高的大豆蛋白可能會(huì)得到很高的DH值,但這還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.