侯 晟, 趙 磊, 楊雪蓮, 王成濤

關(guān)于酵母菌轉(zhuǎn)化3-甲硫基丙醇已有一些報(bào)道.Castillo-lozano等[8]對5株酵母菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),48 h后發(fā)現(xiàn)有少量3-甲硫基丙醇生成;Buzzini等[9]從37株擔(dān)子菌酵母(basidiomycetous yeasts)中發(fā)現(xiàn)有10株能夠轉(zhuǎn)化氨基酸生成3-甲硫基丙醇,恒溫25℃,40 r/min搖床培養(yǎng)72 h,產(chǎn)量為0.04～0.40 g/L;Etschmann等[10]研究了釀酒酵母CEN.PK113-7D補(bǔ)料分批發(fā)酵條件,在5 L發(fā)酵罐中26～36 h向罐中流加葡萄糖,最終在64 h獲得3.5 g/L的3-甲硫基丙醇.本研究利用篩選獲得的一株產(chǎn)3-甲硫基丙醇的酵母菌,通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化條件,希望為微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然香料3-甲硫基丙醇提供技術(shù)支持.

1　材料與方法

1.1　材料

甲醇、乙腈為色譜純,美國Fisher公司;氨基酸,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;產(chǎn)香釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae SC408由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng);酵母膏,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他試劑均為分析純.

1.2　儀器設(shè)備

Waters 2695型四元高效液相色譜儀,2996型光電二極管陣列檢測器,SunFireTMC18(5μm,4.6×150 mm)色譜柱,美國Waters公司.

1.3　HPLC分析方法

流動(dòng)相為乙腈:水.梯度洗脫條件:2%乙腈,2 min;2% ～12%乙腈,2 min;12% ～40%乙腈,5 min;40%～50%乙腈,3 min;50% ～2%乙腈,2 min;2%乙腈,2 min;流速1 mL/min;柱溫30℃;檢測波長210 nm;進(jìn)樣量10μL.

1.4　培養(yǎng)基的制備

種子培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%(斜面固體培養(yǎng)基另加2%瓊脂).

培養(yǎng)基Ⅰ:根據(jù)前期試驗(yàn)摸索,設(shè)計(jì)培養(yǎng)基成分均勻設(shè)計(jì)方案,如表1中各試驗(yàn)號(hào).

表1　培養(yǎng)基組分均勻設(shè)計(jì)方案Tab.1　Design proposal of fermentation on media

將一定量的氨基酸、KH2PO4、K2HPO4、MgCl2、FeCl2、ZnSO4和酵母膏溶于100 mL去離子水中,置于121℃滅菌20 min,冷卻后,倒入已滅菌的含有1 g葡萄糖和0.8 g NaCl的250 mL三角瓶中,混勻即為各試驗(yàn)號(hào)發(fā)酵用培養(yǎng)基.每個(gè)試驗(yàn)號(hào)2組平行.

培養(yǎng)基Ⅱ:按表1中試驗(yàn)號(hào)為2的成分配制,操作同上.

培養(yǎng)基Ⅲ(100 mL):氨基酸0.4%、KH2PO40.8%、K2HPO40.6%、MgCl20.001%、FeCl20.002%、ZnSO40.003%和酵母膏0.08%溶于裝有100 mL去離子水的250 mL三角瓶中,置于121℃滅菌20 min,冷卻后倒入裝有按表2設(shè)計(jì)的已滅菌葡萄糖和NaCl的250 mL三角瓶中,混勻,即為各試驗(yàn)號(hào)發(fā)酵用培養(yǎng)基.每個(gè)試驗(yàn)號(hào)2組平行.

1.5　培養(yǎng)優(yōu)化方法

1.5.1培養(yǎng)基組分的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

根據(jù)前期發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果,從斜面種子培養(yǎng)基挑取1環(huán)接種于上述“培養(yǎng)基Ⅰ”中,30℃,200 r/min搖床培養(yǎng),分別于60,72和84 h取樣,HPLC檢測.

表2　培養(yǎng)條件均勻設(shè)計(jì)方案Tab.2　Design proposal of fermentation condition

1.5.2接種量對3-甲硫基丙醇發(fā)酵和氨基酸轉(zhuǎn)化率的影響實(shí)驗(yàn)

按照2.4培養(yǎng)基的制備方法制備培養(yǎng)基,將30℃,200 r/min搖床培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液按5%和10%分別接種于“培養(yǎng)基Ⅱ”中,同時(shí)分別挑取1環(huán)、2環(huán)和5環(huán)的固體斜面種子接種于“培養(yǎng)基Ⅱ”中,30℃,200 r/min搖床培養(yǎng),在12,24,48,60,72和84 h分別取樣,HPLC檢測.

1.5.3培養(yǎng)條件對3-甲硫基丙醇發(fā)酵的影響實(shí)驗(yàn)

按照1.4培養(yǎng)基的制備方法制備培養(yǎng)基,將30℃,200 r/min搖床培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液按5%接種于各“培養(yǎng)基Ⅲ”中,按表2培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵,在48,60和72 h分別取樣,然后從搖床取出在室溫靜置培養(yǎng),分別于140和384 h取樣,HPLC檢測.

1.5.4優(yōu)化條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照1.4培養(yǎng)基的制備方法制備培養(yǎng)基,將30℃,200 r/min搖床培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液按5%接種于“培養(yǎng)基Ⅲ”中較優(yōu)一組,30℃,200 r/min搖床培養(yǎng),在12～132 h間每12 h取樣(分兩批,一批前72 h取樣,一批后60 h取樣),HPLC檢測,并測定生物量.

1.6　發(fā)酵液的處理及生物量的測定

將發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min,上清液用0.45μm微孔濾膜過濾得液相色譜待測樣液,沉淀物置于105℃干燥箱,干燥至恒重,稱量即得生物量.

2　結(jié)果與分析

2.1　培養(yǎng)基組分優(yōu)化結(jié)果

培養(yǎng)基組分的均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果如圖1,除7號(hào)試樣外,其余各試驗(yàn)號(hào)發(fā)酵液3-甲硫基丙醇濃度在0.70～0.89 g/L,但達(dá)到峰值的時(shí)間不同,2,3,4,5,8,9,10和11號(hào)試樣在60 h達(dá)到峰值,1和6號(hào)試樣在84 h達(dá)到峰值,7號(hào)試樣隨著發(fā)酵時(shí)間的延長產(chǎn)物濃度在升高,但其峰值僅為0.54 g/L.為縮短發(fā)酵時(shí)間,提高氨基酸轉(zhuǎn)化率,選擇2號(hào)培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基.

圖1　培養(yǎng)基組分優(yōu)化試驗(yàn)3-甲硫基丙醇生成的動(dòng)態(tài)曲線Fig.1　Dynamic curve of accumulation of methionol on media optimization

培養(yǎng)基組分優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)各因素多元線性回歸參數(shù)分析結(jié)果如表3.表3表明,在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為10.0 g/L時(shí),3-甲硫基丙醇濃度與KH2PO4、ZnSO4和酵母膏的濃度呈正相關(guān),與K2HPO4,MgCl2和FeCl2的質(zhì)量濃度負(fù)相關(guān),但與氨基酸濃度無關(guān),提示其氨基酸是過量添加.

表3　培養(yǎng)基組分均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)各因素多元線性回歸參數(shù)分析Tab.3　Parameters of linear aggression on media proportion optimization

2.2　接種量對3-甲硫基丙醇發(fā)酵的影響

接種量對3-甲硫基丙醇發(fā)酵的影響見圖2.圖2可以看出,接種量對3-甲硫基丙醇的峰值影響不大(維持在0.9～1.1 g/L),但峰值出現(xiàn)的時(shí)間不同.接種5環(huán)的試樣在48 h達(dá)到峰值,接種1環(huán)、2環(huán)、5%和10%的試樣在60 h達(dá)到峰值,5%接種量試驗(yàn)組生成的目標(biāo)產(chǎn)物濃度最高(P＜0.05),因此后續(xù)試驗(yàn)中選擇5%接種量.

圖2　接種量對3-甲硫基丙醇發(fā)酵的影響Fig.2　Effect of inoculation amounts on 3-(methylthio)-1-propanol accumulation

2.3　培養(yǎng)條件對3-甲硫基丙醇發(fā)酵的影響

培養(yǎng)條件對3-甲硫基丙醇發(fā)酵的影響結(jié)果見圖3.圖3顯示,4號(hào)和6號(hào)試驗(yàn)組的3-甲硫基丙醇濃度明顯高于其他試驗(yàn)組,這兩組產(chǎn)量的發(fā)酵條件發(fā)現(xiàn),其初始葡萄糖質(zhì)量濃度都大于等于20.0 g/L,轉(zhuǎn)速也較高(200 r/min),因此,高含量的葡萄糖有利于菌體生長和3-甲硫基丙醇累積,高溶氧量有利于3-甲硫基丙醇的累積,溫度適中有利于3-甲硫基丙醇的生成.

2.4　優(yōu)化條件的驗(yàn)證結(jié)果

優(yōu)化條件下發(fā)酵底物、目的產(chǎn)物和生物量的同步生長關(guān)系見圖4.由圖4可見,隨著發(fā)酵時(shí)間延長,3-甲硫基丙醇濃度與生物量同步增長(圖4;r=0.94,P＜0.05),表明3-甲硫基丙醇隨著菌體細(xì)胞生長而不斷累積,在132 h達(dá)到1.6 g/L;氨基酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約為72%;從氨基酸的消耗量來看,補(bǔ)料流加氨基酸后,3-甲硫基丙醇仍會(huì)繼續(xù)生成.

圖3　培養(yǎng)條件對3-甲硫基丙醇發(fā)酵的影響Fig.3　Effect of concentration of methionol on different cultivation condition

圖4　優(yōu)化條件下發(fā)酵底物、目的產(chǎn)物和生物量的同步生長關(guān)系Fig.4　Optimized results of concentration of amino acid,methionol and biomass with fermentation time

3　結(jié) 論

通過均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化Saccharomyces cerevisiae SC408的培養(yǎng)基組分為:氨基酸4.0 g/L、KH2PO48.0 g/L、K2HPO46.0 g/L、MgCl20.01 g/L、FeCl20.02 g/L、ZnSO40.03 g/L、酵母膏 0.8 g/L、葡萄糖30.0 g/L和NaCl 2.0 g/L;研究了接種量和培養(yǎng)條件對3-甲硫基丙醇產(chǎn)生的影響,在搖床培養(yǎng)30℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,132 h時(shí)3-甲硫基丙醇的產(chǎn)量達(dá)到1.6 g/L,氨基酸的摩爾轉(zhuǎn)化率約為72%.同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)若控制好底物中葡萄糖濃度和氨基酸濃度,3-甲硫基丙醇的終產(chǎn)物濃度還會(huì)繼續(xù)升高,為今后分批-補(bǔ)料發(fā)酵的擴(kuò)大試驗(yàn)提供有力的支持.

參考文獻(xiàn):