杜健偉，于 瑤，張漢堯

(西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(Internal Transcribed Spacer)序列，是在真核生物基因組中的核糖體中相對(duì)保守的序列，同時(shí)它存在于高度重復(fù)的核糖體中，進(jìn)化相對(duì)迅速而具多態(tài)性且長(zhǎng)度不大，具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，因此是理想的種間鑒定的遺傳標(biāo)記［1］。目前，ITS序列分析已廣泛的應(yīng)用于被子植物的種內(nèi)屬間及種間遺傳關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育和分類研究［2－4］。通過對(duì)西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)3個(gè)不同竹種的ITS序列的分析，并構(gòu)建它們的系統(tǒng)樹，從分子角度探討3個(gè)竹種的分類地位，并為種屬間鑒定提供分子依據(jù)。

本研究使用竹子新鮮葉片基因組中的ITS基因?qū)Υ葘?，剛竹屬，牡竹屬?個(gè)竹種進(jìn)行種間系統(tǒng)關(guān)系的研究，從分子水平分析不同屬間的竹種之間的親緣進(jìn)化關(guān)系。目前，應(yīng)用ITS基因?qū)Σ煌瑢僦穹N間進(jìn)行系統(tǒng)分類研究在國內(nèi)尚未見報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)樣本

實(shí)驗(yàn)用慈竹Neosinocalamus affinis(Rendle)Keng f.，龍竹Dendrocalamus giganteusMunro，紫竹Phyllostachys nigra(Lodd.Ex Lindl.)Munro，均采自西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。采集3個(gè)竹子的新鮮葉片，用液氮將新鮮葉片放入預(yù)冷后的研缽中研磨后，放入超低溫冰箱(－80°)保存。

2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

SX－500高壓蒸汽滅菌鍋，PCR儀型號(hào)為PTC—100型，DZKW電熱恒溫水浴鍋，BS223S電子天平，SW—CJ—2F清潔工作臺(tái)，5804R離心機(jī)，DYY－8C型電泳儀BIO－RAD凝膠成像儀。

引物以及PCR體系2×Taq PCR MasterMix均由昆明碩陽科技有限公司合成及供應(yīng)，DNA提取試劑盒(離心柱型)為BioTeKe品牌，其余試劑均為分析純。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 葉片DNA的提取

用BioTeKe新型快速植物基因組DNA提取試劑盒提取。

3.2 ITS基因序列的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中竹子的ITS基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物擴(kuò)增竹子ITS基因。①引物:上游引物:5'GAT ACT TGG TGT GAA TTG CAG A 3';下游引物:5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3'。②反應(yīng)體系:上游引物 2 μl;下游引物2 μl;2 × Taq PCR MasterMix 25 μl;DNA 模板 2 μl;加滅菌水至 50 μl。③反應(yīng)條件:預(yù)變性:94℃ 6 min;變性:94℃ 30 s，退火:50.8℃ 30 s，延伸:72℃ 90 s，40 cycles;終延伸:72℃ 8 min，產(chǎn)物于4℃ 保存。④PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物5 μl用EB染色的濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像儀照相。

3.3 測(cè)序

將剩余PCR樣品45 ul，委托中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序，采用雙向測(cè)序。

3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

序列的比對(duì)采用軟件 Clustal X 2.0［5］。利用BioEdit version 7.0.5 軟件進(jìn)行人工調(diào)整［6］。運(yùn)用系統(tǒng)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 4.1。進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony，MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，應(yīng)用自展法(Bootstarp，1000 replicates)進(jìn)行可信度檢測(cè)，空位作為完全缺失(Complete deletion)處理，轉(zhuǎn)換(Transition，Ti)和顛換(Transversion，Tv)設(shè)置為相同的權(quán)重，模型選擇核酸－P－distance。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1 樣品ITS－PCR

慈竹，龍竹，紫竹的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得了單一的目的條帶，PCR產(chǎn)物的rDNA ITS區(qū)域的序列片段長(zhǎng)度大約為300 bp～400 bp。PCR擴(kuò)增獲得的目的片段含有5.8S rDNA片段，ITS2全長(zhǎng)，以及26S rDNA片段序列，分別將3條序列提交給NCBI公用數(shù)據(jù)庫GeneBank，選取剛竹屬，牡竹屬，慈屬覆蓋度80% ～90%的竹種(表1)，利用NCBI的軟件BLAST進(jìn)行網(wǎng)上對(duì)比。

表1 供試竹類植物材料Table1 Bamboo species used in this study

4.2 樣品ITS序列分析

利用Clustal X 2.0對(duì)DNA序列完成排序，并按Kimura－2參考模型用MEGA軟件計(jì)算序列間的分化距離，得到Kimura－2參數(shù)遺傳距離(Kimura－2 parameter genetic distance)，使用 MEGA 4.1 軟件1000次重復(fù)抽樣計(jì)算出鄰近樹(NJ)。

經(jīng)軟件Clustal X 2.0和MEGA 4.1分析表明，3個(gè)竹種的ITS序列長(zhǎng)度范圍為381 bp～390 bp，其中A，T，G和 C堿基的平均含量為別為16.1%，10.7%，34.2%，39.1%。ITS為339個(gè)位點(diǎn)(空位作為缺失處理)，恒定位點(diǎn)281個(gè)，Parsim-info簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)39個(gè)，variable變異位點(diǎn)為54個(gè)，Singleton單個(gè)堿基變化位點(diǎn)15個(gè)。5.8 s片段，ITS2，26 s片段的3個(gè)區(qū)變異較大，因此適用于作系統(tǒng)發(fā)育分析。

4.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，慈竹、龍竹和簕竹屬的兩個(gè)竹種與牡竹屬的5個(gè)竹種聚為一類，紫竹與剛竹屬的4個(gè)竹種聚為一類，結(jié)果表明利用龍竹和紫竹在同屬之間的親緣關(guān)系較近，這支持了現(xiàn)在目前有關(guān)于龍竹與紫竹的系統(tǒng)分類，而在系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出慈竹與牡竹屬的竹種親緣關(guān)系較近，這為利用ITS序列對(duì)竹類植物的系統(tǒng)分類提供了理論依據(jù)。

圖1 用MEGA 4.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行NJ分析得到竹種系統(tǒng)樹

5 討論

試驗(yàn)中采集的材料均采自西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，可能存在因人工栽培而造成的種質(zhì)漂移的可能性。將測(cè)序后所得ITS序列在BLAST上進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì)，選取覆蓋度80% ～90%的同屬竹種(慈竹選取簕竹屬兩個(gè)竹種)進(jìn)行序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本文對(duì)慈竹，紫竹，龍竹3個(gè)竹種的ITS進(jìn)行分析和討論，為3個(gè)竹種在植物分類學(xué)的研究上提供了分子水平證據(jù)和基礎(chǔ)資料。

從已發(fā)表的論文來看，前人已有較多關(guān)于利用ITS序列分析研究植物的系統(tǒng)發(fā)育文章，如鄭曼莉等利用ITS(nrDNA)和matk(cpDNA)探討姜族植物的系統(tǒng)發(fā)育［7］，李璐濱等利用葉綠體5S rDNA ITS和matK基因序列對(duì)剛竹屬植物系統(tǒng)分類進(jìn)行的的可行性分析［8］。被子植物ITS1區(qū)與ITS2區(qū)的序列長(zhǎng)度變異很小(均小于300 bp)，但我們的結(jié)果不支持這一結(jié)論，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)用的3個(gè)竹種的ITS序列長(zhǎng)度范圍為381 bp～390 bp。本研究通過對(duì)3個(gè)竹種與相應(yīng)屬竹種序列比較分析表明，利用ITS序列對(duì)竹種的系統(tǒng)分類有一定的借鑒作用。因?yàn)樵谔接懸恍┍蛔又参锟苾?nèi)的系統(tǒng)發(fā)育時(shí)，ITS區(qū)提供的信息是很有價(jià)值，它使我們對(duì)被子植物系統(tǒng)進(jìn)化的認(rèn)識(shí)又向前跨了一步［9］。

［1］ CHU K H，LI C P，HO H Y.The first internal transcribed spacer(ITS1)of ribosomal DNA as a molecular makers for phylogenetic and population analyses in crustacean［J］.Mar Biotechnol(N Y)，2001，3(4):355～361.

［2］ 李建強(qiáng)，王恒昌，李曉東，等.基于細(xì)胞核rDNA ITS片段的水青岡屬的分子系統(tǒng)發(fā)育［J］.武漢植物學(xué)研究，2003，21(1):31～36.

［3］ 李學(xué)營，彭建營，白瑞霞.基于核rDNA的ITS序列在種子植物系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2005，20(5):829～834.

［4］ 趙志禮，徐珞珊，董輝，等.核糖體DNA ITS區(qū)序列在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的價(jià)值［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2000，9(2):50～54.

［5］ Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al.Clusta1 Wand Clustal X version 2.0［J］.Bioinformatics，2007，23:2947 ～ 2948.

［6］ Tamura K，Dudley J，Nei M ，et al.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24:1596 ～1599.

［7］ 鄭曼莉，夏永梅.利用ITS(nrDNA)和matK(cpDNA)探討姜族植物的系統(tǒng)發(fā)育［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，32(S1):426～432.

［8］ 李潞濱，劉蕾，袁金玲等.葉綠體5S rDNA ITS和matK基因序列應(yīng)用于剛竹屬植物系統(tǒng)分類的可行性分析［J］.分子植物育種，2009，7(1):89 ～94.

［9］ Baldwin B G，Sanderson M J，Porter J M，et al.The ITS region of nuclear ribosomal DNA:a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny［J］.Ann Missouri Bot Gard，1995，82:247 ～277.