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        竹種內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核苷酸(ITS)序列分析

        2011-06-26 02:08:52杜健偉張漢堯
        四川林業(yè)科技 2011年6期
        關(guān)鍵詞:慈竹紫竹竹種

        杜健偉,于 瑤,張漢堯

        (西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224)

        內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(Internal Transcribed Spacer)序列,是在真核生物基因組中的核糖體中相對(duì)保守的序列,同時(shí)它存在于高度重復(fù)的核糖體中,進(jìn)化相對(duì)迅速而具多態(tài)性且長(zhǎng)度不大,具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性,因此是理想的種間鑒定的遺傳標(biāo)記[1]。目前,ITS序列分析已廣泛的應(yīng)用于被子植物的種內(nèi)屬間及種間遺傳關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育和分類研究[2-4]。通過對(duì)西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)3個(gè)不同竹種的ITS序列的分析,并構(gòu)建它們的系統(tǒng)樹,從分子角度探討3個(gè)竹種的分類地位,并為種屬間鑒定提供分子依據(jù)。

        本研究使用竹子新鮮葉片基因組中的ITS基因?qū)Υ葘?,剛竹屬,牡竹屬?個(gè)竹種進(jìn)行種間系統(tǒng)關(guān)系的研究,從分子水平分析不同屬間的竹種之間的親緣進(jìn)化關(guān)系。目前,應(yīng)用ITS基因?qū)Σ煌瑢僦穹N間進(jìn)行系統(tǒng)分類研究在國內(nèi)尚未見報(bào)道。

        1 實(shí)驗(yàn)樣本

        實(shí)驗(yàn)用慈竹Neosinocalamus affinis(Rendle)Keng f.,龍竹Dendrocalamus giganteusMunro,紫竹Phyllostachys nigra(Lodd.Ex Lindl.)Munro,均采自西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。采集3個(gè)竹子的新鮮葉片,用液氮將新鮮葉片放入預(yù)冷后的研缽中研磨后,放入超低溫冰箱(-80°)保存。

        2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

        SX-500高壓蒸汽滅菌鍋,PCR儀型號(hào)為PTC—100型,DZKW電熱恒溫水浴鍋,BS223S電子天平,SW—CJ—2F清潔工作臺(tái),5804R離心機(jī),DYY-8C型電泳儀BIO-RAD凝膠成像儀。

        引物以及PCR體系2×Taq PCR MasterMix均由昆明碩陽科技有限公司合成及供應(yīng),DNA提取試劑盒(離心柱型)為BioTeKe品牌,其余試劑均為分析純。

        3 實(shí)驗(yàn)方法

        3.1 葉片DNA的提取

        用BioTeKe新型快速植物基因組DNA提取試劑盒提取。

        3.2 ITS基因序列的PCR擴(kuò)增

        根據(jù)GenBank中竹子的ITS基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物擴(kuò)增竹子ITS基因。①引物:上游引物:5'GAT ACT TGG TGT GAA TTG CAG A 3';下游引物:5'TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3'。②反應(yīng)體系:上游引物 2 μl;下游引物2 μl;2 × Taq PCR MasterMix 25 μl;DNA 模板 2 μl;加滅菌水至 50 μl。③反應(yīng)條件:預(yù)變性:94℃ 6 min;變性:94℃ 30 s,退火:50.8℃ 30 s,延伸:72℃ 90 s,40 cycles;終延伸:72℃ 8 min,產(chǎn)物于4℃ 保存。④PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物5 μl用EB染色的濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用凝膠成像儀照相。

        3.3 測(cè)序

        將剩余PCR樣品45 ul,委托中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序,采用雙向測(cè)序。

        3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

        序列的比對(duì)采用軟件 Clustal X 2.0[5]。利用BioEdit version 7.0.5 軟件進(jìn)行人工調(diào)整[6]。運(yùn)用系統(tǒng)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA 4.1。進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,以最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony,MP)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,應(yīng)用自展法(Bootstarp,1000 replicates)進(jìn)行可信度檢測(cè),空位作為完全缺失(Complete deletion)處理,轉(zhuǎn)換(Transition,Ti)和顛換(Transversion,Tv)設(shè)置為相同的權(quán)重,模型選擇核酸-P-distance。

        4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        4.1 樣品ITS-PCR

        慈竹,龍竹,紫竹的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得了單一的目的條帶,PCR產(chǎn)物的rDNA ITS區(qū)域的序列片段長(zhǎng)度大約為300 bp~400 bp。PCR擴(kuò)增獲得的目的片段含有5.8S rDNA片段,ITS2全長(zhǎng),以及26S rDNA片段序列,分別將3條序列提交給NCBI公用數(shù)據(jù)庫GeneBank,選取剛竹屬,牡竹屬,慈屬覆蓋度80% ~90%的竹種(表1),利用NCBI的軟件BLAST進(jìn)行網(wǎng)上對(duì)比。

        表1 供試竹類植物材料Table1 Bamboo species used in this study

        4.2 樣品ITS序列分析

        利用Clustal X 2.0對(duì)DNA序列完成排序,并按Kimura-2參考模型用MEGA軟件計(jì)算序列間的分化距離,得到Kimura-2參數(shù)遺傳距離(Kimura-2 parameter genetic distance),使用 MEGA 4.1 軟件1000次重復(fù)抽樣計(jì)算出鄰近樹(NJ)。

        經(jīng)軟件Clustal X 2.0和MEGA 4.1分析表明,3個(gè)竹種的ITS序列長(zhǎng)度范圍為381 bp~390 bp,其中A,T,G和 C堿基的平均含量為別為16.1%,10.7%,34.2%,39.1%。ITS為339個(gè)位點(diǎn)(空位作為缺失處理),恒定位點(diǎn)281個(gè),Parsim-info簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)39個(gè),variable變異位點(diǎn)為54個(gè),Singleton單個(gè)堿基變化位點(diǎn)15個(gè)。5.8 s片段,ITS2,26 s片段的3個(gè)區(qū)變異較大,因此適用于作系統(tǒng)發(fā)育分析。

        4.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

        用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示,慈竹、龍竹和簕竹屬的兩個(gè)竹種與牡竹屬的5個(gè)竹種聚為一類,紫竹與剛竹屬的4個(gè)竹種聚為一類,結(jié)果表明利用龍竹和紫竹在同屬之間的親緣關(guān)系較近,這支持了現(xiàn)在目前有關(guān)于龍竹與紫竹的系統(tǒng)分類,而在系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出慈竹與牡竹屬的竹種親緣關(guān)系較近,這為利用ITS序列對(duì)竹類植物的系統(tǒng)分類提供了理論依據(jù)。

        圖1 用MEGA 4.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行NJ分析得到竹種系統(tǒng)樹

        5 討論

        試驗(yàn)中采集的材料均采自西南林業(yè)大學(xué)校園內(nèi),可能存在因人工栽培而造成的種質(zhì)漂移的可能性。將測(cè)序后所得ITS序列在BLAST上進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì),選取覆蓋度80% ~90%的同屬竹種(慈竹選取簕竹屬兩個(gè)竹種)進(jìn)行序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本文對(duì)慈竹,紫竹,龍竹3個(gè)竹種的ITS進(jìn)行分析和討論,為3個(gè)竹種在植物分類學(xué)的研究上提供了分子水平證據(jù)和基礎(chǔ)資料。

        從已發(fā)表的論文來看,前人已有較多關(guān)于利用ITS序列分析研究植物的系統(tǒng)發(fā)育文章,如鄭曼莉等利用ITS(nrDNA)和matk(cpDNA)探討姜族植物的系統(tǒng)發(fā)育[7],李璐濱等利用葉綠體5S rDNA ITS和matK基因序列對(duì)剛竹屬植物系統(tǒng)分類進(jìn)行的的可行性分析[8]。被子植物ITS1區(qū)與ITS2區(qū)的序列長(zhǎng)度變異很小(均小于300 bp),但我們的結(jié)果不支持這一結(jié)論,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)用的3個(gè)竹種的ITS序列長(zhǎng)度范圍為381 bp~390 bp。本研究通過對(duì)3個(gè)竹種與相應(yīng)屬竹種序列比較分析表明,利用ITS序列對(duì)竹種的系統(tǒng)分類有一定的借鑒作用。因?yàn)樵谔接懸恍┍蛔又参锟苾?nèi)的系統(tǒng)發(fā)育時(shí),ITS區(qū)提供的信息是很有價(jià)值,它使我們對(duì)被子植物系統(tǒng)進(jìn)化的認(rèn)識(shí)又向前跨了一步[9]。

        [1] CHU K H,LI C P,HO H Y.The first internal transcribed spacer(ITS1)of ribosomal DNA as a molecular makers for phylogenetic and population analyses in crustacean[J].Mar Biotechnol(N Y),2001,3(4):355~361.

        [2] 李建強(qiáng),王恒昌,李曉東,等.基于細(xì)胞核rDNA ITS片段的水青岡屬的分子系統(tǒng)發(fā)育[J].武漢植物學(xué)研究,2003,21(1):31~36.

        [3] 李學(xué)營,彭建營,白瑞霞.基于核rDNA的ITS序列在種子植物系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報(bào),2005,20(5):829~834.

        [4] 趙志禮,徐珞珊,董輝,等.核糖體DNA ITS區(qū)序列在植物分子系統(tǒng)學(xué)研究中的價(jià)值[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2000,9(2):50~54.

        [5] Larkin M A,Blackshields G,Brown N P,et al.Clusta1 Wand Clustal X version 2.0[J].Bioinformatics,2007,23:2947 ~ 2948.

        [6] Tamura K,Dudley J,Nei M ,et al.MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0[J].Molecular Biology and Evolution,2007,24:1596 ~1599.

        [7] 鄭曼莉,夏永梅.利用ITS(nrDNA)和matK(cpDNA)探討姜族植物的系統(tǒng)發(fā)育[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2010,32(S1):426~432.

        [8] 李潞濱,劉蕾,袁金玲等.葉綠體5S rDNA ITS和matK基因序列應(yīng)用于剛竹屬植物系統(tǒng)分類的可行性分析[J].分子植物育種,2009,7(1):89 ~94.

        [9] Baldwin B G,Sanderson M J,Porter J M,et al.The ITS region of nuclear ribosomal DNA:a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny[J].Ann Missouri Bot Gard,1995,82:247 ~277.

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