文│陳 崗（四川省自貢市動物疫病預(yù)防控制中心）沈 潔（四川省自貢市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校）

芽孢桿菌制劑是一種廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的微生態(tài)制劑，能抵抗各種不良環(huán)境，對熱、pH值和鹽具有廣泛耐受性，特別是芽孢桿菌可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、β-寡糖酶、超氧化物歧化酶等，因此，芽孢桿菌制劑在畜牧業(yè)和發(fā)酵工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。寡糖作為一種新型的寡糖添加劑，具有穩(wěn)定性好、用量小及來源豐富等特點(diǎn)。目前，國內(nèi)外對益生素和寡糖的研究主要集中在提高動物生產(chǎn)性能、改善腸道微生態(tài)環(huán)境方面，而對動物腸道黏膜的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)影響沒有系統(tǒng)報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過對家兔飼喂芽孢桿菌制劑和寡糖制劑，研究其腸道黏膜生長抑素（SS）在小腸黏膜中的分布及其數(shù)量變化，從而為研究微生態(tài)制劑和寡糖與動物腸道黏膜神經(jīng)內(nèi)分泌免疫的關(guān)系，提供進(jìn)一步的試驗(yàn)依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料。

（1）實(shí)驗(yàn)動物及基礎(chǔ)日糧。48只40日齡斷奶加利福尼亞兔，雄性，預(yù)試五天后，體重750±101克，購自四川省自貢市畜牧局種畜場。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧：參照家兔的營養(yǎng)需要，基礎(chǔ)日糧配方見表1。

表1 家兔基礎(chǔ)日糧配方%

（2）芽孢桿菌制劑和低聚糖。芽孢桿菌PAS38制劑：由自貢市動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室研制。β-寡糖制劑：購自湖北天琪生物工程有限公司，濃度＞99%。

2.方法。

（1）試驗(yàn)分組及管理。將48只40日齡加利福尼亞兔隨機(jī)分為芽孢（0.1%蠟樣芽孢桿菌）組（簡稱BG）、寡糖（0.15%β-寡糖）組（簡稱OG）、混合（0.1%蠟樣芽孢桿菌＋0.15%β-寡糖）組（簡稱MG）、對照組（簡稱CG），每組12只，見表2。飼喂時(shí)間為50天，其中預(yù)試期5天，正式試驗(yàn)45天。早上8點(diǎn)和晚上6點(diǎn)各喂一次飼料。日糧每天按組分別稱量飼喂，并將前次未采食完的日糧全部收集曬干稱重。自由飲水，中午給予同樣質(zhì)量的青貯飼料。兔舍上下午各打掃一次，保持兔舍內(nèi)空氣新鮮，保持周圍環(huán)境安靜，做好記錄。每日平均溫度為（26±2）℃。

表2 試驗(yàn)家兔分組情況

（2）標(biāo)本制備。所有實(shí)驗(yàn)動物于正式飼喂第15、30、45日早上8:00空腹稱重后各組宰殺4只，采取空腸、十二指腸各一段，放入4%多聚甲醛中固定24小時(shí)，制成5微米厚的石蠟切片，用APES處理載玻片，用于生長抑素（SS）的免疫組化分析。

（3）免疫組織化學(xué)染色方法。石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物的活性10分鐘，微波修復(fù)抗原1～2次，正常山羊血清封閉非特異性背景20分鐘，依次加入一抗（Mouse Anti-Rabbit Somatostatin，抗體濃度1∶200，4℃過夜），二抗（生物素標(biāo)記的山羊抗兔，室溫20分鐘），SABC復(fù)合物室溫20分鐘，以上各步間均以PBS緩沖液（0.02摩爾/升，pH7.6）洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片，觀察，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。用PBS代替一抗作為陰性對照。

（4）顯微圖像分析及結(jié)果處理。在顯微鏡下觀察，拍照。每例動物隨機(jī)選取5張切片，每張切片選取10個(gè)400倍視野計(jì)數(shù)，運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，并用LSD法做顯著性比較。

二、結(jié)果

SS陽性細(xì)胞主要分布在腸絨毛上皮之間，腸腺中分布較少。SS細(xì)胞中充滿免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)，尤以基底部及核周圍明顯，在細(xì)胞基底面及側(cè)面細(xì)胞膜外可見免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)溢出，但腸腔及腺腔內(nèi)未見免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)。十二指腸內(nèi)SS免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞多呈圓形和橢圓形，多數(shù)細(xì)胞為開放型，可見細(xì)胞的突起伸向腺腔或腸腔面，見圖1～2。

1.飼料中添加芽孢桿菌和β-寡糖對家兔十二指腸SS陽性細(xì)胞的影響。在陽性細(xì)胞密度方面，芽孢組十二指腸中SS陽性細(xì)胞數(shù)量比對照組顯著減少（P＜0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，芽孢組和寡糖組十二指腸中SS比對照組顯著減少（P＜0.05），而混合組比對照組極顯著減少（P＜0.01）；飼喂45天之后，各實(shí)驗(yàn)組十二指腸中SS陽性細(xì)胞數(shù)量已恢復(fù)正常水平，與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）結(jié)果見表3和圖3。

圖1 十二指腸SS陽性細(xì)胞，SABC×400

圖2 空腸SS陽性細(xì)胞，SABC×400

表3 家兔小腸中SS陽性細(xì)胞密度變化（±s，個(gè)）

在平均灰度值方面，飼喂15天后，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組十二指腸中SS陽性細(xì)胞平均灰度值與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組十二指腸中SS平均灰度值比對照組顯著升高（P＜0.05）；飼喂45天之后，各實(shí)驗(yàn)組十二指腸中SS陽性細(xì)胞平均灰度值已接近對照組水平，與對照組比較無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果見表4和圖4。

表4 家兔小腸中SS陽性細(xì)胞平均灰度變化（±s）

2.飼料中添加芽孢桿菌和β-寡糖對家兔空腸SS陽性細(xì)胞的影響。在陽性細(xì)胞密度方面，飼喂15天后，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組空腸中SS陽性細(xì)胞數(shù)量均比對照組顯著減少（P＜0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，寡糖組空腸中SS陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05），芽孢組和混合組空腸中SS極顯著減少（p＜0.01）；飼喂45天之后，芽孢組和寡糖組空腸中SS陽性細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)恢復(fù)正常水平，而混合組與對照組相比，仍有顯著差異（p＜0.05）， 結(jié)果見表3和圖5。

圖3 各組家兔十二指腸SS陽性細(xì)胞數(shù)量變化的比較

圖4 各組家兔十二指腸SS陽性細(xì)胞平均灰度值變化的比較

圖5 各組家兔空腸SS陽性細(xì)胞數(shù)量變化的比較

圖6 各組家兔空腸SS陽性細(xì)胞平均灰度值變化的比較

在平均灰度值方面，飼喂15天后，芽孢組和混合組空腸中SS陽性細(xì)胞平均灰度值均比對照組顯著升高（P＜0.05）；飼喂30天后，與對照組相比，寡糖組空腸中SS陽性細(xì)胞平均灰度值顯著升高（P＜0.05），芽孢組和混合組極顯著升高（P＜0.01）；飼喂45天之后，芽孢組和寡糖組空腸中SS平均灰度值已經(jīng)接近對照組水平，而混合組與對照組相比，仍有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果見表4和圖6。

三、討論

生長抑素（Somatostatin，SS）陽性細(xì)胞分布很廣泛，不僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且存在于所有動物的胃腸道中，是小腸中一種主要的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞。SS對胃腸道消化吸收及其他內(nèi)分泌細(xì)胞起普遍性的抑制作用，如抑制幾乎所有胃腸激素如胃泌素、血管活性腸肽、胰泌素和胃動素等的分泌；抑制胃腸運(yùn)動，因此對機(jī)體的消化吸收功能有重要影響。許多研究表明SS影響小腸的黏膜免疫反應(yīng)，楊倩等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著SS水平的降低，小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）的數(shù)量有明顯增多。SS還可以抑制T淋巴細(xì)胞的活動和淋巴細(xì)胞免疫球蛋白的合成，SIgA是黏膜免疫中最主要的效應(yīng)因子，SIgA不僅能防止病原微生物在黏膜表面的黏附，還可以通過中和黏膜上皮內(nèi)的病原體來捕獲進(jìn)入到黏膜內(nèi)層的病原體，而SS對IgA合成的抑制作用可高達(dá)20%～50%。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）作為顯色劑對SS陽性細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，與Porter報(bào)道結(jié)果基本一致，SS陽性細(xì)胞主要分布在腸絨毛上皮之間，細(xì)胞多為圓形和橢圓形，有突起，屬開放型分泌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芽孢桿菌和寡糖均能夠使家兔小腸中SS陽性細(xì)胞密度降低，降低了SS對其他內(nèi)分泌細(xì)胞和胃腸激素的抑制作用，從而增強(qiáng)了胃腸道的消化吸收功能。在小腸固有層中存在大量的免疫細(xì)胞，如IgA陽性細(xì)胞、肥大細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等，研究發(fā)現(xiàn)，這些免疫細(xì)胞上存在SS受體，小腸中SS陽性細(xì)胞數(shù)量的減少也可使這些免疫細(xì)胞的數(shù)量增加，從而提高小腸的局部免疫功能。從飼喂的各個(gè)時(shí)期來看，芽孢組小腸中SS陽性細(xì)胞的平均數(shù)量均低于寡糖組，說明了兩者單獨(dú)使用時(shí)，芽孢桿菌對內(nèi)分泌免疫的調(diào)節(jié)作用要優(yōu)于寡糖。兩者聯(lián)合使用之后，小腸中SS陽性細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步減少，這可能是因?yàn)楣烟强梢宰鳛橐嫔脑鲋硠?，促進(jìn)了芽孢桿菌在腸道中增殖，從而使兩者表現(xiàn)出一定的協(xié)同效應(yīng)。