謝世平 馬素娜 劉偉 陳玉龍 崔永霞 許前磊 張寧 王娟 溫冠曉

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新組學(xué)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它通過運用現(xiàn)代儀器檢測分析手段，定性或定量研究觀察生物樣本中所有可檢測的代謝產(chǎn)物的綜合表現(xiàn)，探討生物體對外源性物質(zhì)以及遺傳變異的應(yīng)答等所引起的病理生理變化反應(yīng)，將這些變化反應(yīng)與代謝信息中的生物學(xué)相關(guān)事件聯(lián)系起來，以檢測活細(xì)胞中的化學(xué)變化及其生物學(xué)意義［1］。由于其具有與中醫(yī)學(xué)整體觀、即時性相一致的特點，將成為生命科學(xué)研究者研究中醫(yī)“證”本質(zhì)的有力工具［2］。通過運用代謝組學(xué)的研究方法，尋找艾滋病患者尿液中的特異代謝產(chǎn)物，為中醫(yī)藥在診斷和防治艾滋病進(jìn)展中的作用提供先進(jìn)的技術(shù)支持。

1 對象與方法

1.1 對象

共納入研究對象20例，均為漢族，農(nóng)民。其中疾病觀察組12例均為來源于河南省某地區(qū)的艾滋病病毒攜帶者、艾滋病患者(HIV/AIDS)脾肺氣虛證者。健康對照組8例，均為當(dāng)?shù)亟】等?。疾病觀察組:男6例(50%)、女6例(50%);年齡31～40歲1例(8.3%)、41～50歲 6例(50%)、51～60歲 5例(41.7%);已婚9例(75%)、離異1例(8.3%)、喪偶2例(16.7%)。健康對照組:男4例(50%)、女4例(50%);20～30歲1例(12.5%)、31～40歲1例(12.5%)、41～50歲3例(37.5%)、51～60歲3例(37.5%);已婚7例(87.5%)、未婚 1例(12.5%)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析兩組對象一般資料差異無顯著性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用國家衛(wèi)生部2005年推薦《艾滋病診療指南》診斷標(biāo)準(zhǔn):有流行病學(xué)史、實驗室檢查HIV抗體陽性。

中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn):以課題組前期對HIV/AIDS患者大樣本中醫(yī)證候?qū)W的臨床調(diào)查的研究成果為基礎(chǔ)［國家自然科學(xué)基金項目(90409004):艾滋病中醫(yī)證候分布規(guī)律及證候標(biāo)準(zhǔn)建立與驗證］，擬定艾滋病中醫(yī)常見基本證候辨證標(biāo)準(zhǔn)中脾肺氣虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)。中醫(yī)證候脾肺氣虛證相關(guān)的癥狀和體征:動則氣喘、易感冒、咳痰清稀、咳聲低微、自汗、神疲乏力、惡風(fēng)寒、心慌心悸、胸悶、泄瀉、便溏、舌體胖大、舌質(zhì)淡或淡白、舌苔薄白、脈象虛或細(xì)弱等。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

疾病觀察組的納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HIV確認(rèn)試驗陽性;(2)符合《HIV/AIDS常見中醫(yī)證候診斷量表》中脾肺氣虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)，中醫(yī)辨證須經(jīng)兩名副主任中醫(yī)師以上職稱醫(yī)生診斷一致;(3)年齡在18～60歲;(4)簽署知情同意書。

健康對照組的納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HIV抗體陰性;(2)身體健康無臟器嚴(yán)重疾病或慢性病急性發(fā)作者;(3)無神志不清、癡呆、各種精神病患者;(4)非妊娠或哺乳期婦女;(5)年齡在18～60歲之間;(6)能配合調(diào)查并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)不符合以上納入標(biāo)準(zhǔn)者;(2)非因感染艾滋病所患的臟器嚴(yán)重疾病，原發(fā)性免疫缺陷，激素化療等引起的繼發(fā)性免疫缺陷，血液病，其它原因引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1.5 儀器及試劑

主要儀器設(shè)備:LCQ Advantage MAX電噴霧離子阱液質(zhì)聯(lián)用儀(美國賽默飛世爾科技公司);色譜柱(Agilent Zorbax C18)(150 ×2.1mm，3.1μm);高速冷凍離心機(jī)(Jouan MR23i)(法國Jouan公司);低溫冰箱(MDF5411)(日本三洋株式會社);超純水器(MiII-QSyntheSiS)(美國MiIIPore公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

主要試劑:乙腈(色譜純級，購自Merck公司);甲酸 (HPLC/SPECTRO級，購自Tedia公司);甲醇(色譜純級，購自 Merck公司);高純氮氣(純度＞99.99%);高純氦氣(純度＞99.99%)。

1.6 尿液樣品的預(yù)處理

用EP管收集正常對照組、脾肺氣虛證組和濕熱內(nèi)蘊證組研究對象的晨尿2 ml，移取1 ml尿液，4000轉(zhuǎn)/分高速離心10分鐘，取上清液。精密移取上清液 300 μl，置 1.5 ml離心管中，加入 600 μl甲醇，用混勻器混勻約10分鐘，然后高速離心10分鐘，14000 轉(zhuǎn)/分，4 ℃ 控溫，取上清液 800 μl，用0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液，低溫冰箱保存。

1.7 液相色譜—質(zhì)譜條件

(1)液相色譜條件:色譜柱為Agilent Zorbax C18(150×2.1 mm，3.1 μm);流動相:0.2%冰醋酸水—甲醇梯度洗脫(見表1);流速:0.2 ml/min;進(jìn)樣盤溫度:4℃;進(jìn)樣量:20 μl;柱溫:30℃;色譜圖采集時間不少于60分鐘。(2)質(zhì)譜條件:掃描方式:一級全掃描;鞘氣流速:4000 kpa;輔助氣流速:1000 kpa;噴霧電壓:4 kV;毛細(xì)管電壓:-4 V;毛細(xì)管溫度:300℃，質(zhì)荷比范圍:80～1000，采用負(fù)離子掃描模式。

1.8 液質(zhì)聯(lián)用分析方法學(xué)考察

(1)空白溶劑考察:取供試品制備所用甲醇—水(2∶1)，按照梯度洗脫條件進(jìn)樣，考察空白溶劑產(chǎn)生的干擾，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時，扣除空白溶劑的干擾。(2)精密度試驗考察:取供試品溶液(如正常對照組10號樣本)，重復(fù)進(jìn)樣6次，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，考察儀器的精密度，多次測量樣本相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD% ＜3%。(3)重復(fù)性試驗考察:取同一患者的尿液，分別制樣6份，行色譜分析，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，考察方法的重復(fù)性，RSD% ＜3%;(4)穩(wěn)定性試驗考察:取供試品溶液(如健康對照組10 號樣本)，分別于 0、1、2、4、8、12 小時穩(wěn)定電壓行色譜分析，以總離子流圖中各色譜峰的保留時間和峰面積為指標(biāo)，考察樣品穩(wěn)定性，RSD% ＜3%。

表1 液相色譜法冰醋酸水—甲醇洗脫梯度表

1.9 數(shù)據(jù)分析

(1)經(jīng)質(zhì)譜分析儀器自帶軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)(質(zhì)荷比對應(yīng)的峰強(qiáng)度)Excel文件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，篩選原則為:每個證型中相同質(zhì)荷比(數(shù)據(jù)上下浮動在±1的定義為同一類物質(zhì))。(2)對所篩選出的差異結(jié)果通過SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗分析，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)P值、各組間相同質(zhì)荷比均數(shù)(同一質(zhì)荷比對應(yīng)的不同分組中所有樣本峰強(qiáng)度的均數(shù))的比值(以1.5倍原則)進(jìn)行篩選，篩選出差異物質(zhì)，通過比較兩組間相應(yīng)代謝產(chǎn)物的峰值明確其變化的趨勢(增多或減少)。(3)對其中有顯著差異的數(shù)據(jù)采用PCA模式識別分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

空白溶劑考察結(jié)果顯示試劑無干擾;精密度考察、重復(fù)性和穩(wěn)定性考察結(jié)果表明儀器精密度良好、方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.2 指紋圖譜(見圖1～2)

2.3 t檢驗分析

從圖3可以看出在HIV/AIDS脾肺氣虛證組中質(zhì)荷比分別為 794、618、339、502、118、384 的 6 種物質(zhì)與正常組相比峰強(qiáng)度均減小，且相差大于1.5倍。質(zhì)荷比為 412、413、368、229、286、287、325、327、529、299、210、347、311、329、331、303、345、523、505、295、300、213、521、507、293、365 的 26 種物質(zhì)在HIV/AIDS脾肺氣虛證組峰強(qiáng)度明顯的高于健康對照組，相差遠(yuǎn)大于1.5倍。兩組物質(zhì)經(jīng)t檢驗均P＜0.05，差異有明顯性。其中質(zhì)荷比為412、505、794、118、329、331 的 6 種物質(zhì)，在兩組中峰度均較高且兩組差異明顯?？赡転閮山M間的特異性物質(zhì)。

2.4 PCA分析結(jié)果

數(shù)據(jù)用正交信號校正(Orthogonal Signal Correction，OSC)后進(jìn)行偏最小二乘模式識別(Partial Least Squares-discriminant analysis，PLS-DA)分析。從變量散點圖(plot)中可發(fā)現(xiàn)顯著差異的變量，即為“生物標(biāo)志物”。

從圖4中可以看出:健康對照組(■所示)和HIV/AIDS脾肺氣虛證組(◆所示)兩組間能明顯的區(qū)分開，兩組之間存在顯著的差異。

從圖5中可以看出在分子量為352、388、618、562、502、159、560、384、794、109、101、118、117、125、339的離子物與其他離子相距較遠(yuǎn)，可以認(rèn)為是艾滋病病人脾肺氣虛證組相對于健康對照組的潛在標(biāo)志物。

從圖6中可以看到:第一主成分:R2Y=0.59，Q2=0.51;第二主成分:R2Y=0.86，Q2=0.75，這說明:第一主成分代表了整體信息的程度為59%左右，預(yù)測率為51%左右;第二主成分可以代表整體樣本信息的程度為27%左右，預(yù)測率為24%左右。前兩個主成分對整體樣本信息的覆蓋程度為80%，整體預(yù)測率為75%。這可以認(rèn)為是一個很理想的模型，它對大部分的數(shù)據(jù)(主成分)都能進(jìn)行解釋，且預(yù)測率較高，預(yù)測能力強(qiáng)，結(jié)果意義可信。

3 討論

圖5 健康對照組與脾肺氣虛組PLOT圖

中醫(yī)藥認(rèn)識疾病的方法、理論均缺乏合適的現(xiàn)代科學(xué)表達(dá)體系，目前仍是一種不能與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相兼容、相通的“語言”。要進(jìn)一步實現(xiàn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化和國際化，其根本在于用現(xiàn)代科學(xué)語言闡釋中醫(yī)獨特的理論體系。代謝組學(xué)通過獲取體內(nèi)動態(tài)變化的綜合信息了解人體可能受影響的部位和環(huán)節(jié)，這與傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)“思外揣內(nèi)”的診治方法具有內(nèi)在的同一性，代謝組學(xué)是一種較全面的系統(tǒng)的研究技術(shù)，在方法學(xué)上具有融整體、動態(tài)、綜合、分析于一體的特點，采用代謝組學(xué)這種現(xiàn)代醫(yī)學(xué)承認(rèn)的尖端技術(shù)可以克服中醫(yī)傳統(tǒng)方法的局限，成為適合現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的重要技術(shù)手段，成為溝通中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的橋梁。而且無論是中醫(yī)的“證”還是代謝組學(xué)，研究的都是致病因素作用于人體后機(jī)體某一階段反映的病理性變化的綜合情況，二者皆從機(jī)體整體變化的角度進(jìn)行評價分析，共同體現(xiàn)了即時性、整體性的特點。中醫(yī)“證”是辨證論治的起點和核心，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)可以分析中醫(yī)證候的特異性代謝產(chǎn)物或標(biāo)志物，進(jìn)而促進(jìn)中醫(yī)證候的客觀化和證本質(zhì)的研究，為中醫(yī)證候診斷的量化、客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化提供方法和依據(jù)［3］。

本研究運用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與主成分分析方法相結(jié)合來研究HIV/AIDS脾肺氣虛證患者與健康對照研究對象的尿液代謝輪廓的差異，結(jié)果顯示該方法能夠?qū)山M間的尿液代謝輪廓進(jìn)行良好的區(qū)分(PLS-DA圖)，HIV/AIDS脾肺氣虛證患者組相對與健康對照組存在著顯著的差異物質(zhì)或物質(zhì)群(PLOT圖)?；谝嘿|(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合PCA模式識別的代謝組學(xué)的研究方法是一種可以用于研究機(jī)體復(fù)雜病理生理變化的先進(jìn)的技術(shù)方法，或許可以成為揭示中醫(yī)證候本質(zhì)研究的強(qiáng)有力的工具。

本次研究通過探索HIV/AIDS脾肺氣虛證的代謝物質(zhì)的差異，嘗試為中醫(yī)藥在診斷和防治艾滋病進(jìn)展中的作用研究提供嶄新的思路，嘗試為中醫(yī)證本質(zhì)研究，更為臨床多種疾病的診斷和防治提供新的思路和方法。

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