栗艷齡，梁建萍，馬躍龍，羅鳳霞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院，山西 太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801;3.金陵科技學(xué)院 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210038)

東方百合“索蚌”自交不親合性的研究

栗艷齡1，梁建萍2，馬躍龍1，羅鳳霞3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 信息學(xué)院，山西 太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801;3.金陵科技學(xué)院 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210038)

為研究百合自交不親和發(fā)生的部位，以東方百合索蚌為試驗(yàn)材料，采用蕾期授粉、切割花柱授粉、延后授粉對(duì)東方百合索蚌自交后的花粉管生長(zhǎng)和結(jié)實(shí)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：索蚌自交不親和性表現(xiàn)在花柱和子房中;蕾期授粉具有明顯的花柱不親和性;保留0.5cm花柱授粉能夠克服花柱不親和，花粉管可以進(jìn)入子房，但坐果率為零，受精障礙存在于子房;延后6d柱頭授粉能夠克服索蚌的自交不親和性，結(jié)實(shí)率可以達(dá)到26.7%，但每果有胚4.0個(gè)。

索蚌;不親和;花粉管;結(jié)實(shí)

自交不親和性也叫自交不育性，是指能產(chǎn)生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同體植物，在自花授粉或相同基因型異花授粉時(shí)不能完成受精的現(xiàn)象，是花粉與雌蕊之間表現(xiàn)抑制作用所致，實(shí)質(zhì)上是自花授粉時(shí)受精過程受阻。百合科的成熟花粉粒是由一個(gè)營養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)生殖細(xì)胞構(gòu)成的二核花粉粒。根據(jù)孟金陵［1］所述，具二核花粉粒的物種表現(xiàn)為配子體不親和性，所謂配子體不親和性，是指花粉的不親和反應(yīng)是由花粉本身（配子體)的單倍體基因型決定的。在配子體不親和反應(yīng)中，共同細(xì)胞質(zhì)中不存在特異物質(zhì)，而特異物質(zhì)是在各個(gè)小孢子內(nèi)形成的。所以，這類植物的花粉可以萌發(fā)并進(jìn)入花柱。但是，當(dāng)花粉中的特異物質(zhì)與花柱中的相應(yīng)物質(zhì)由于擴(kuò)散而發(fā)生反應(yīng)時(shí)，花粉管的生長(zhǎng)就會(huì)停止，不親和性表現(xiàn)在花柱內(nèi)。針對(duì)百合不親和性的特點(diǎn)，克服其方法大體上有切除柱頭、切割花柱，應(yīng)用化學(xué)調(diào)節(jié)劑，蕾期授粉和延遲授粉，離體授粉，混和花粉授粉，子房?jī)?nèi)授粉，染色體加倍，輻射花粉，熱助授粉，注意正反交、改變雜交親本染色體倍數(shù)、橋梁雜交等［2，3］。

索蚌“Sorbonne”是東方百合的一個(gè)品種，育種試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其具有很高的自交不親和性，得不到后代。本試驗(yàn)采用蕾期授粉、切割花柱授粉、延遲授粉三種常用克服不親和性的試驗(yàn)方法，運(yùn)用熒光顯微法觀測(cè)，結(jié)合留種試驗(yàn)，目的在于研究百合自交不親和發(fā)生的部位及克服百合自交不親和的有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

東方百合雜交種索蚌“Sorbonne”

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花蕾級(jí)別判定

設(shè)開花當(dāng)天的花蕾為0級(jí)，開花前2d的花蕾為－2級(jí)，開花后2d的花蕾為＋2級(jí)，依次類推，直到－6級(jí)和＋6級(jí)（見表1)。

1.2.2 授粉方法

－6到－2級(jí)別的花在授粉前1d去雄，其余級(jí)別的花均在開花前1d去雄，對(duì)開花當(dāng)天0級(jí)的花采用常規(guī)柱頭授粉（對(duì)照)，僅切柱頭授粉以及切掉1／2花柱授粉，保留0.5cm花柱授粉4種授粉方法，其余級(jí)別的花蕾均采用常規(guī)柱頭授粉，每一級(jí)別或每種授粉方式均授50朵，授粉時(shí)間定在每天上午8：30～10：00。加強(qiáng)對(duì)留種母株的養(yǎng)護(hù)管理，兩個(gè)月后采摘果實(shí)，測(cè)量其長(zhǎng)和寬，計(jì)算蒴果的膨大系數(shù)，膨大系數(shù)＝果實(shí)膨大寬度／果實(shí)長(zhǎng);統(tǒng)計(jì)其坐果率和有胚種子率，坐果率（%)＝坐果數(shù)／授粉數(shù)×100，有胚種子率（%)＝有胚胚珠數(shù)／子房中胚珠數(shù)×100。

1.2.3 花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)觀察

授粉后4、24、48、96、144h，取下花柱和子房放入FAA固定液（甲醛∶冰乙酸∶70%酒精＝1∶1∶18體積比)中，每個(gè)處理5個(gè)，固定24h后，放入75%酒精保存?zhèn)溆?。然后再將樣品放? mol·L－1NaOH溶液中，60℃下進(jìn)行軟化至全透明狀，再用蒸餾水清洗3次去除NaOH，放入0.1%水溶性苯胺藍(lán)（0.1mol·L－1K3PO4)溶液中染色24h，用BH-2型Olympus熒光顯微鏡觀測(cè)、記錄、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同級(jí)別花蕾授粉后花粉管生長(zhǎng)行為觀察

由表1和圖1綜合分析可知，授粉后4h，對(duì)照，＋2，＋4，＋6級(jí)花蕾授粉花粉粒均萌發(fā)，花粉管呈黃綠色（見圖2中1)，生長(zhǎng)情況幾乎無差別，其余級(jí)別花蕾和切割花柱授粉花粉粒仍處于靜止?fàn)顟B(tài)或少數(shù)透亮，此時(shí)，－2、－4、－6級(jí)花蕾和切割花柱授粉的花粉粒缺乏柱頭分泌的粘液，導(dǎo)致花粉萌發(fā)慢，說明柱頭分泌物中可能含有促進(jìn)花粉萌發(fā)的物質(zhì)。

圖1 不同級(jí)別花蕾授粉后花粉管生長(zhǎng)長(zhǎng)度Fig.1 The length of pollen tube growth to different grades buds after pollination

表1 索蚌各級(jí)花蕾調(diào)查情況Table 1 The investigation of different buds in Sorbonne

授粉后24h，對(duì)于‘＋’級(jí)花蕾，隨著級(jí)別的增加，花粉萌發(fā)的越多，花粉管伸長(zhǎng)的越長(zhǎng)，且花粉管突破柱頭乳突組織向花柱道中延伸的數(shù)量也增加（見圖2中2、3、4)，‘－’級(jí)花蕾，僅是零星萌發(fā)（見圖2中5、6)。

授粉后48h，花蕾級(jí)別越高，花粉管延伸的越長(zhǎng)，＋6級(jí)的花粉管已經(jīng)超過了整個(gè)花柱的1／5，對(duì)照的花粉管剛接近花柱的1／6，－2級(jí)花粉管突破柱頭乳突組織有向下延伸的跡象（見圖2中7)，－4，－6級(jí)還停留在乳突，且花粉管數(shù)量仍未增加，未萌發(fā)花粉也沒有要萌發(fā)的跡象（見圖2中8)，切頭和切1／2花柱的花粉管伸長(zhǎng)的沒有對(duì)照長(zhǎng)，且后者要比前者花粉管數(shù)量少，說明上部花柱的存在可能對(duì)花粉管生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，可以嘗試采用上部花柱與子房嫁接授粉方法。保留0.5cm花柱的花粉管剛到達(dá)子房口（見圖2中9)。

授粉后96h，對(duì)照中花粉管到達(dá)花柱的1／4，＋6級(jí)花粉管穿過花柱的1／3，＋2，＋4級(jí)花粉管長(zhǎng)度處于對(duì)照和＋6級(jí)中間，－2級(jí)花粉管延伸還不到花柱的1／6，－4，－6級(jí)花粉管幾乎沒伸長(zhǎng)，處于停滯狀態(tài)（見圖2中10、11)，切頭后花粉管伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度比切1／2花柱的長(zhǎng)，保留0.5cm花柱的花粉管已進(jìn)入子房與胚珠結(jié)合（見圖2中12)，說明保留0.5cm花柱授粉能夠克服下部花柱對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制作用。

授粉后144h，對(duì)于延后授粉，依然是隨延后時(shí)間的增加，花粉管伸長(zhǎng)的越長(zhǎng)，且花粉管數(shù)量也逐級(jí)增加（見圖2中13、14、15)，＋6級(jí)花粉管到達(dá)花柱的2／3，對(duì)照中花粉管還未達(dá)花柱的1／3，＋2，＋4級(jí)花粉管長(zhǎng)度超過花柱的1／3，－2級(jí)花粉管也延伸到花柱的1／5，－4，－6級(jí)花粉管依然是零增長(zhǎng)，切頭的和切1／2花柱的花粉管長(zhǎng)度達(dá)到整個(gè)花柱的1／4。

由此可見，花蕾級(jí)別越高，花器官發(fā)育得越成熟，花粉管生長(zhǎng)得越好，說明成熟的花器官為花粉管的生長(zhǎng)創(chuàng)造了良好的條件，根據(jù)楊曉苓［4］對(duì)雌蕊中保護(hù)酶和激素的研究及Iwanami Y［5］對(duì)花粉管生長(zhǎng)的研究，推測(cè)柱頭、花柱、子房中積累了大量促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)的物質(zhì)，在分泌細(xì)胞的引導(dǎo)下，花粉管向下生長(zhǎng)。另外，在切割花柱授粉中，發(fā)現(xiàn)下部花柱對(duì)花粉管的抑制程度大于上部花柱，保留0.5 cm花柱授粉是相對(duì)有效的。

2.2 不同級(jí)別花蕾授粉對(duì)結(jié)實(shí)的影響

由表2可知，隨著花蕾級(jí)別的增加，子房膨大個(gè)數(shù)和膨大系數(shù)也在增加，但花蕾只有在＋6級(jí)時(shí)授粉有效，且坐果率達(dá)26.7%，這說明延后6d授粉，花冠部分更趨于成熟，柱頭、花柱、子房、胚珠更具備了受精能力，抑制花粉管生長(zhǎng)的脫落酸等物質(zhì)不會(huì)對(duì)花粉管造成影響，但有胚種子率相對(duì)較低，推測(cè)遲遲來到的精子與卵細(xì)胞生理結(jié)構(gòu)不相匹配，不能完成正常受精，也許是受精后早期胚敗育，需要適時(shí)進(jìn)行早期子房切片、胚珠或幼胚離體培養(yǎng);

圖2 不同級(jí)別花蕾授粉后花粉管生長(zhǎng)狀況Fig.2 The condition of pollen tube growth to different grades buds after pollination

表2 索蚌各級(jí)花蕾授粉結(jié)實(shí)情況Table 2 The seeds of different grades＇buds after pollination in Sorbonne

＋2、＋4級(jí)授粉后膨大系數(shù)也相對(duì)較高，這與花粉管伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度較長(zhǎng)是相對(duì)應(yīng)的，但坐果率為零，可能是由于花粉管伸長(zhǎng)得越長(zhǎng)，釋放的雄激素信號(hào)傳遞到子房越快，對(duì)子房刺激作用越大造成的，也可能是由幼胚早期敗育引起的;

切割花柱授粉中，切1／2花柱和保留0.5cm花柱授粉后的子房都呈膨大現(xiàn)象，且后者子房膨大系數(shù)接近延后6d授粉子房膨大系數(shù)，發(fā)現(xiàn)依然未坐果。先前觀察到后者花粉管于授粉后96h已到達(dá)胚珠（見圖2中12)，說明切割花柱授粉能夠影響花粉管的生長(zhǎng)，切得越長(zhǎng)，花粉管進(jìn)入子房的可能性越大，同時(shí)推測(cè)由于缺少花柱的緩沖作用，使得進(jìn)入子房花粉管的數(shù)量減少，這樣就減少了受精的機(jī)會(huì)，而得不到有胚種子;也可能是后期胚敗育;也許是花粉管提前進(jìn)入子房，雌雄配子生理上存在差異，可以嘗試延后6d的切割花柱授粉，以上情況有待進(jìn)一步研究。

－2、－4級(jí)花蕾授粉，子房輕微膨大，此時(shí)花冠部分并未成熟，尤其是先端柱頭還未分泌粘液，不能使花粉更好地萌發(fā)，萌發(fā)的花粉也由于花柱的不成熟，花粉管不能健康生長(zhǎng)，導(dǎo)致后期受精障礙;

0級(jí)花蕾授粉，子房膨大系數(shù)不及切割花柱（除切柱頭)和延后授粉的子房膨大系數(shù)，此時(shí)花冠部分基本成熟，可能花柱中促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)的物質(zhì)還未產(chǎn)生或某些抑制花粉管生長(zhǎng)的物質(zhì)產(chǎn)生，導(dǎo)致花粉管畸形生長(zhǎng)，后期發(fā)生受精障礙，因此，－2、－4級(jí)和0級(jí)授粉均無效，不能坐果結(jié)籽。－6級(jí)花蕾各花器過于幼嫩，授粉也無效。

3 結(jié)論與討論

采用蕾期常規(guī)授粉不能克服索蚌自交不親和性，存在著花柱障礙，授粉不成功。一方面缺乏了柱頭分泌物，另一方面也許是花粉中的特異物質(zhì)與未成熟花柱中的相應(yīng)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，阻礙花粉管生長(zhǎng)。據(jù)Shivanna［6］研究，認(rèn)為蕾期授粉是克服自交不親和性最為成功的方法。可見，蕾期授粉方式在自交不親和應(yīng)用方面有一定的局限性。

采用保留0.5cm花柱授粉能夠克服花柱不親和，但不能克服子房不親和。據(jù)齊國輝［7］研究報(bào)道，梨花柱中高水平的IAA、GA3和ZR有利于授粉受精正常進(jìn)行，花柱中低水平的生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)IAA、GA3和ZR使自交不親和不結(jié)實(shí)。楊曉苓［4］也報(bào)道，自交親和、雜交不親和均能引起雌蕊中保護(hù)酶和激素的協(xié)同作用。切1／2花柱和保留0.5 cm花柱授粉效果優(yōu)于切柱頭授粉，子房膨大系數(shù)可觀，但沒有坐果，可能是花柱中缺乏IAA、GA3和ZR內(nèi)源激素及酶活性的誘導(dǎo)，導(dǎo)致后期受精發(fā)生障礙，也許是雌雄生殖器官生理上的差異或早期胚敗育，仍需進(jìn)一步對(duì)受精過程中各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行研究。

采用延后6d授粉有效，能夠克服索蚌的自交不親和性。前人［8～10］研究發(fā)現(xiàn)，花粉管尖端有大量鈣離子通道分布，它們開放后會(huì)使花粉管前端形成一定的鈣離子濃度梯度，該梯度控制著花粉管伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的速度和方向。據(jù)張紹鈴［11］研究報(bào)道，梨花柱中存在一種特異性的降解自花花粉管RNA的核糖核酸酶。據(jù)楊曉苓［4］等研究，不親和授粉雌蕊中ABA始終高于自交授粉，高水平的ABA與雜交不親和授粉有關(guān)。推測(cè)花器官發(fā)育越成熟，花粉管前端鈣離子通道越開放，更容易控制花粉管伸長(zhǎng)速度和方向;同時(shí)，降解自花花粉管RNA的核糖核酸酶和ABA含量的合成也減少，這樣對(duì)花粉管生長(zhǎng)和受精的阻礙作用就減小，致使子房膨大系數(shù)較高，但坐果率僅26.7%，種子有胚率只有1.51%，說明提高索蚌自交結(jié)實(shí)率還需在胚搶救方面進(jìn)一步研究探討。

可見，索蚌的不親和性在花柱和子房中都存在，要想徹底搞清楚，除了采用多種克服自交不親和性的方法之外，還需要從生理指標(biāo)和分子水平上對(duì)受精過程中雌蕊產(chǎn)生的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和研究，以期為百合雜交育種工作排除受精障礙提供一定的理論基礎(chǔ)。

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Study on the Self-incompatibility inLiliumorentialSorbonne

LI Yan-ling1，LIANG Jian-ping2，MA Yue-long1，LUO Feng-xia3
（1.CollegeofInformation，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;2.CollegeofLifeSciences，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;3.CollegeofHorticulture，JinlingInstitute ofTechnology，NanjingJiangsu210038，China)

In order to study the position of self-incompatibility inLilium，withLiliumorentialSorbonne as material，pollen tube＇s growth and seed formation inLiliumorentialSorbonne inLiliumwere studied by bud pollination，cut-different-style pollination and delayed pollination.The results suggested that the self-incompatibility in Sorbonne manifested in style and ovary.The pollination on buds showed apparant style incompatibility.Retaining 0.5cm style pollination could bypass style incompatibility，the pollen tube could get into the ovary，but the fruit-setting rate was zero and the fertilization failure existed in ovary.The delayed 6dstigma pollination could overcome self-incompatibility in Sorbonne and the fruit-setting rate was 26.7%，but the number of embryos was four in every fruit.

Sorbonne;Self-incompatibility;Pollen tube;Seeds

S682.2

A

1671-8151（2011)06-0506-06

2011-06-20

2011-08-20

栗艷齡（1981-)，女（漢)，山西長(zhǎng)治人，助教，碩士，主要從事花卉遺傳育種方面的研究。

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX（09)608)

（編輯：武英耀)