何 浪,李國軍,劉光波,王 丹△

(1.成都醫(yī)學院生物醫(yī)學系 610081;2.成都醫(yī)學院臨床醫(yī)學本科2007級 610081;3.遼寧建筑職業(yè)技術(shù)學院,遼寧遼陽111000)

在細胞毒性實驗中,M TT比色法自1983年建立以來[1],已成為細胞生物學及相關(guān)研究領(lǐng)域的一種分析細胞活性、生長增殖和抗癌藥物篩選及臨床腫瘤藥敏試驗的常用方法[2]。但該法需加入二甲基亞砜(DMSO)溶解甲臜顆粒,可能遇到顆粒不完全溶解以及在吸取上清液的操作中易帶走部分細胞等問題。利用 Cell counting kit-8(CCK-8)檢測細胞活性的方法(WST-8法)[3]。只需將CCK-8試劑按比例加入到細胞培養(yǎng)板中,經(jīng)過一定時間孵育,活細胞即可將WST-8代謝為水溶性的甲臜染料,即可直接測定細胞活性[4]。現(xiàn)將MT T、WST-8法檢測三羥異黃酮(genistein,GEN)對SW480細胞的生長抑制比較報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細胞SW480(成都醫(yī)學院生物技術(shù)實驗室保存)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、M TT,GEN。活細胞計數(shù)試劑盒CCK-8、WST-8試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 試劑 GEN用DMSO溶解,實驗時用RPM I1640培養(yǎng)液稀釋,終濃度分別為25、50、100、200 mol/L[5],DMSO 終濃度小于0.1%。

1.3 細胞培養(yǎng) 選用對數(shù)生長期、臺盼藍拒染率大于95%的SW480細胞,用含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液培養(yǎng),含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 g/mL,置 37 ℃、5%CO2溫箱中,2～3 d換液1次,當細胞豐度超過 80%時傳代。

1.4 M TT、WST-8法檢測GEN對SW480細胞生長的抑制作用 將處于對數(shù)生長期的SW480細胞用0.25%胰蛋白酶消化,6×103/孔接種于96孔板中?？瞻讓φ占尤牒珼MSO的RPMI1640培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2。細胞貼壁,進入指數(shù)生長期后,加入不同濃度 GEN 培養(yǎng)液(0、25、50、100、200 mol/L)200μL,每個濃度設8個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后分別用MTT、WST-8法測定各孔的光密度(optical density,OD)值(分別為A570、A450,以空白對照調(diào)零)。具體操作按試劑說明書進行。以下公式計算出GEN對SW480細胞生長抑制率:

細胞生長抑制率=(1-藥物組OD值/細胞對照組OD值)×100%。

1.5 WST-8法孵育時間 細胞接種同上,給藥48 h后加20 μ L CCK-8溶液,細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5、1、2、4 h,分別測定各孔的OD值(A450,以空白對照調(diào)零)。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間OD值比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。生長抑制率的比較采用配對計量資料的符號秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

兩種測定方法均表明,GEN作用48 h后SW480細胞的生長明顯受抑制,并且隨著GEN濃度的增加,這種抑制作用亦增強。這兩種測定方法所得GEN在25～200 mol/L各濃度時對SW480細胞的生長抑制率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。不同濃度GEN作用后的加入CCK-8試劑后孵育不同時間,隨孵育時間增加,OD值逐漸增加至4 h時已足夠用于測量,但在孵育1～2 h之間,OD值增幅較小,GEN濃度分別為 25、50、100、200 mol/L 時,趨勢相同,故認為對于SW480細胞,WST-8法測量 OD值的最佳時間為孵育1～2 h。1～2 h中,WST-8法OD值高于MT T法,短時間內(nèi)反映細胞增殖抑制狀況優(yōu)于M TT法,見表2。

表1 兩種方法測定GEN作用后抑制率比較

表2 兩種方法不同作用時間后OD值比較(±s)

表2 兩種方法不同作用時間后OD值比較(±s)

加MT T或CCK-8后繼續(xù)孵育時間 MT T法 WST-8法1 h 0.257±0.046 0.430±0.035 2 h 0.380±0.016 0.477±0.055

3 討 論

GEN是大豆中主要的異黃酮成分,已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以抑制多種腫瘤細胞的生長,成為一種很有潛力的生物抗腫瘤藥物,但其具體機制尚未完全清楚[6-9]。本研究表明,GEN能對結(jié)腸癌SW480細胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用,這種作用存在濃度依賴性。但是用兩種方法測定的細胞生長抑制率無統(tǒng)計學差異,故認為兩種方法均能準確反映細胞的增殖抑制狀況。

CCK-8試劑中含有WST-8,其化學名稱為2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽。WST-8在電子載體1-Methoxy PMS的作用下能被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲臜物,生成的甲臜數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比,通過酶標儀測量細胞液的A450,可檢測出待測細胞樣品的活性[3]。同時,反應所生成甲臜晶體數(shù)量與加入檢測試劑后繼續(xù)培養(yǎng)的時間之間具有較大的相關(guān)性,且對不同種類的細胞在恰當?shù)臋z測時機方面均存在細微的差別。本研究結(jié)果顯示,WST-8法短時間內(nèi)反映細胞增殖抑制狀況優(yōu)于M TT法。

綜上所述,M TT、WST-8法用于細胞活性計數(shù)最終結(jié)果相似,而WST-8法與M TT法相比操作相對簡便,短時間內(nèi)測定反映細胞增殖狀況優(yōu)于M TT法,應用價值較大。WST-8法結(jié)果不僅客觀準確,且大大減輕工作量和時間,具有一定的實用性和經(jīng)濟性。

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