郝艷坤，何志鵬，魏韜

肥胖是心血管病的重要危險因素[1]，肥胖與心腦血管病的關(guān)系已倍受臨床重視。本研究選用合成的高脂飼料，成功地建立了肥胖不同易感性動物模型[2]。采用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)檢測胞內(nèi)Ca2+的變化情況。

1 材料與方法

1.1 肥胖易感性動物模型的建立 健康成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180～200 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠給予高脂飼料喂飼2周后，根據(jù)體質(zhì)量增加量排序，選出位于中間的1/4鼠(15只)為基礎(chǔ)對照組(基礎(chǔ)組)，繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料，其余大鼠繼續(xù)喂飼高脂飼料。在第8周時，再次按照體質(zhì)量增加量排序，上1/3鼠(15只)為肥胖組，下1/3鼠(15只)為抵抗組，中間1/3鼠(15只)剔除。實(shí)驗(yàn)飼料參考了美國分析化學(xué)學(xué)會(AOAC)配方和美國營養(yǎng)學(xué)會(AIN)實(shí)驗(yàn)大鼠合成飼料配方[3]。

1.2 血清及體脂肪含量的測定 大鼠用水合氯醛35 mg/kg麻醉后，打開腹腔，自腹主動脈迅速采血2 ml，靜置30 min，1000 r/min離心20 min，－80℃保存待用。用血清學(xué)試劑盒和血清自動生化分析儀測量血脂濃度指標(biāo)。留取睪周脂肪組織、腎周脂肪組織和網(wǎng)膜脂肪組織，計算體脂肪含量。

體脂肪含量(%)=(睪周脂肪+腎周脂肪+網(wǎng)膜脂肪)/體質(zhì)量×100%

1.3 心肌細(xì)胞的分離與Fluo-3/AM負(fù)載 水合氯醛溶液麻醉后，迅速開胸取出心臟，置于正常臺氏液中，修剪組織后，主動脈逆行插管連在Langendorff離體灌流裝置上。先用正常臺氏液連續(xù)灌流5 min，然后用無鈣臺氏液繼續(xù)灌流至心臟停搏，最后用濃度為0.02%膠原酶Ⅱ(8 mg/50 ml)和牛血清白蛋白(8 mg/50 ml)的無鈣臺氏液灌流分離心肌細(xì)胞。取分離穩(wěn)定好的細(xì)胞，800 r/min離心3 min，去除上清液。分別用1/8、1/4、1/2、1倍有鈣液進(jìn)行梯度覆蓋，每個10 min。用5 μmol/L Fluo-3/AM避光，37℃溫箱染色40 min。1000 r/min離心1 min，去除負(fù)載液，用正常臺式液沖洗2次，再用正常臺式液將細(xì)胞稀釋到所需濃度待用。

1.4 大鼠心肌細(xì)胞胞漿Ca2+濃度([Ca2+]i)測定 取分離后的細(xì)胞置于自制浴槽中，共聚焦激光掃描顯微鏡下選取桿狀、橫紋清晰無顆粒的細(xì)胞開始實(shí)驗(yàn)。在Time series模式下對XY平面的細(xì)胞掃描，每10 s采集一次數(shù)據(jù)，連續(xù)采集30次?；A(chǔ)熒光值按最小噪聲最大圖像信號人為設(shè)定。預(yù)掃描獲得基礎(chǔ)值后，于第2次和第3次掃描之間，在有鈣液中加入終濃度為30 mmol/L KCl，在無鈣液中加入10 mmol/L咖啡因進(jìn)行掃描。平均熒光強(qiáng)度以給藥后與給藥前的熒光強(qiáng)度比值(FI∶FIo)表示[4-5]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以()表示，組間比較采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量 至第12周時，基礎(chǔ)組、肥胖組和抵抗組大鼠體質(zhì)量分別為(520.57±49.87)g、(553.43±46.21)g、(507.00±40.59)g，肥胖組較抵抗組質(zhì)量大(P＜0.05)；基礎(chǔ)組、肥胖組和抵抗組體質(zhì)量增量分別為(312.01±12.24)g、(350.29±12.57)g、(266.77±11.81)g，肥胖組與基礎(chǔ)組、肥胖組與抵抗組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 體脂肪 肥胖組大鼠睪周脂肪、腎周脂肪、網(wǎng)膜脂肪和體脂比與基礎(chǔ)組和抵抗組大鼠比較均有增高(P＜0.05)。見表1。

2.3 血脂 肥胖組大鼠血漿血清總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白的濃度均高于基礎(chǔ)組和抵抗組大鼠(P＜0.05)；肥胖組大鼠血漿高密度脂蛋白與基礎(chǔ)組和抵抗組大鼠比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體脂及血脂水平比較(n=15)

2.4 KCl誘導(dǎo)[Ca2+]i的變化 基礎(chǔ)組、肥胖組與抵抗組大鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i平均熒光強(qiáng)度分別升高(6.33±0.56)、(4.74±0.29)和(9.14±0.57)倍，肥胖組較基礎(chǔ)組及抵抗組降低(P＜0.05)。

2.5 咖啡因誘導(dǎo)[Ca2+]i的變化 基礎(chǔ)組、肥胖組與抵抗組大鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i平均熒光強(qiáng)度分別升高(3.54±0.27)、(2.67±0.24)和(4.62±0.28)倍，肥胖組較基礎(chǔ)組及抵抗組降低(P＜0.05)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過高脂飲食篩選出肥胖易感性不同的大鼠，測定發(fā)現(xiàn)，在體質(zhì)量增量、各部位脂肪濕重、體脂肪含量、三酰甘油等指標(biāo)方面，肥胖組較基礎(chǔ)組升；抵抗組動物的各項(xiàng)指標(biāo)與基礎(chǔ)組相近。提示飲食篩選出的肥胖與肥胖抵抗動物模型較為理想。

已有研究提示，肥胖者體內(nèi)大量脂肪積聚，促進(jìn)瘦素合成分泌，可導(dǎo)致鈣離子通道、鈉鈣交換體等調(diào)控細(xì)胞內(nèi)鈣平衡的蛋白質(zhì)功能紊亂。實(shí)驗(yàn)證明，肥胖大鼠心律失常的發(fā)生率顯著高于正常大鼠[6]。導(dǎo)致肥胖大鼠心律失常易感性增高的因素可能是多方面的，如各種離子通道重構(gòu)和失衡等都可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜穩(wěn)定性異常[7]。其中，Ca2+由于其第二信使的功能和介導(dǎo)興奮-收縮耦聯(lián)的作用，成為影響心肌電生理和收縮功能的核心離子。細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度的變化和失衡是形成觸發(fā)活動，引發(fā)早后除極、遲后除極，誘導(dǎo)多種心律失常發(fā)生的根本機(jī)制。

我們應(yīng)用共聚焦技術(shù)發(fā)現(xiàn)，肥胖組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣在KCl除極后[Ca2+]i平均熒光強(qiáng)度明顯低于基礎(chǔ)對照組和肥胖抵抗組大鼠，提示肥胖可使大鼠心室肌內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生改變，可能是造成肥胖易發(fā)生心律失常的因素之一。

心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平衡由內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流共同調(diào)節(jié)[7]。本實(shí)驗(yàn)在無鈣環(huán)境采用咖啡因誘導(dǎo)鈣瞬變，與基礎(chǔ)對照組和肥胖抵抗大鼠相比，肥胖組大鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度下降，提示肌漿網(wǎng)鈣釋放量和速率下降可能是由內(nèi)鈣釋放降低造成的。

綜上所述，肥胖心肌細(xì)胞內(nèi)鈣發(fā)生顯著改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)離子的平衡被打破，可能是肥胖心律失常的機(jī)制之一。該研究對今后開發(fā)預(yù)防治療肥胖對心血管系統(tǒng)影響具有理論指導(dǎo)意義。

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[5]陳志勇,王玲,潘振偉,等.三氧化二砷對海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)改離子濃度的影響[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)校報,2007,41(1):16-18.

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