王剛 周廣東 蔣朝華 曹衛(wèi)剛

肢體淋巴水腫是淋巴循環(huán)系統(tǒng)最常見的疾病之一，其原因為淋巴管先天發(fā)育不良或繼發(fā)性淋巴管阻塞等。目前，淋巴水腫的治療方法包括物理治療及手術(shù)治療等，雖然有一定效果，但仍不理想。尋求有效、簡便、安全且能針對淋巴水腫的治療方法，一直是國內(nèi)外淋巴醫(yī)學(xué)工作者努力的方向。

近年來，應(yīng)用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose derived stem cells，ADSC）修復(fù)缺血損傷的研究已顯示出良好的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，ADSC在體內(nèi)可以向血管內(nèi)皮分化，形成血液回流的通道，從而修復(fù)缺血損傷[1]。另外，促進(jìn)淋巴管再生的研究發(fā)展也很快，如VEGF-c與其受體VEGFR-3相互作用可促進(jìn)受損區(qū)淋巴管再生，可減輕肢體淋巴水腫[2]。血液循環(huán)與淋巴循環(huán)具有同源性，ADSC是否可用于淋巴管修復(fù)？能否形成淋巴回流的通道？如果可行的話，因ADSC來源廣，獲取的細(xì)胞數(shù)量多，且對病人損傷小，無疑可以成為淋巴水腫的新的治療方法。

本研究通過分離提取ADSC，并植入鼠尾淋巴水腫淋巴回流阻塞區(qū)，通過微淋巴管熒光示蹤，檢測其是否可以參與淋巴管再生并促進(jìn)急性淋巴水腫的消退。

1 材料與方法

1.1 主要的實驗儀器與試劑

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Forma，美國）；培養(yǎng)皿（Corning，美國）；50 mL 離心管（Falcon，美國）；低速離心機(jī)（Heraeus，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；熒光體式顯微鏡（Leica，德國）；手術(shù)顯微鏡；游標(biāo)卡尺；膠原酶NB4（包含Ⅰ型膠原酶，Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶1，Serva公司），MesenPRO RS Medium（Gibco，美國），DMEM （HyClone，美國），胎牛血清 （SAFC Bioscience， 美國）；PBS 緩沖液；Dextran rhodamine（Eugene Oregon，美國）。

1.2 主要培養(yǎng)液和試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：LG－DMEM，10%胎牛血清，L-谷氨酰胺 300 μg/mL，抗壞血酸 50 μg/mL，青霉素、鏈霉素各100 U/mL。

成骨誘導(dǎo)液：LG-DMEM，10%胎牛血清，L-谷氨酰胺 300 μg/mL，抗壞血酸 50 μg/mL，青霉素、鏈霉素各 100 U/mL，10 mM β-磷酸甘油、10 nM 維生素D3。

1.3 ADSC的分離、培養(yǎng)與成骨誘導(dǎo)分化

將6周齡的GFP小鼠腹股溝部位的脂肪作為ADSC的來源。用氯霉素滅菌水反復(fù)沖洗脂肪，用等體積膠原酶消化 （0.075%）1.5 h。1 500 r/min離心10 min，收集底層沉淀物。將細(xì)胞震蕩混勻，細(xì)胞計數(shù)儀常規(guī)計數(shù)有核細(xì)胞數(shù)。按4×105cells／cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)。將接種細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養(yǎng)。48 h后進(jìn)行首次換液，PBS沖洗去除漂浮組織及血細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)。每隔3～4 d換液，直至細(xì)胞接近80%融合時進(jìn)行傳代，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。 以（0.5～1）×l04cells／cm2細(xì)胞密度接種于新的培養(yǎng)皿內(nèi)。再次達(dá)到80%融合繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取第2代細(xì)胞用于成骨誘導(dǎo)，誘導(dǎo)2周后進(jìn)行茜素紅染色。

1.4 建立鼠尾淋巴水腫模型

取15只6周齡的C57小鼠，腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛0.1 mL。麻醉成功后，鼠尾根部用75%乙醇消毒，尾基部切開皮膚達(dá)深筋膜，環(huán)形切除寬為1 mm的皮膚，鼠尾尖部皮內(nèi)注射亞甲藍(lán)0.01 mL，使切除部位的兩條深層淋巴管均顯色并將其阻斷。

1.5 將ADSC植入鼠尾淋巴水腫模型阻塞區(qū)

取第一代ADSC，0.25%胰酶消化，PBS重懸，制成細(xì)胞懸液40 μL，細(xì)胞計數(shù)約為2×106cells/mL。將細(xì)胞懸液注入到鼠尾淋巴回流阻塞區(qū)（在模型制作30 d后），分別于近心端和遠(yuǎn)心端等量注射。每隔7 d重復(fù)注射（n＝10）。 對照組（n＝5）注射等量生理鹽水。

1.6 鼠尾直徑測量與鼠尾淋巴管熒光示蹤

在動物模型制作完成后，每隔3 d測量鼠尾直徑并記錄。在距第一次植入后30 d做尾尖皮內(nèi)注射Lysine-fixable rhodamine dextran(700 KDa，Molecular Prob，紅色熒光)10 μL，注射后 10 min，用熒光體式顯微鏡觀察鼠尾淋巴回流的情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞接種5 h后，開始貼壁，24～48 h內(nèi)細(xì)胞形態(tài)呈小圓形，色深；48 h后細(xì)胞伸展呈成纖維細(xì)胞樣；72 h后克隆開始形成；傳代后細(xì)胞仍呈成纖維細(xì)胞樣生長（圖1-A，B）。

2.2 成骨誘導(dǎo)分化

ADSC在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3周，行茜素紅染色，可見紫紅色結(jié)晶沉積（圖 1-C，D），說明 ADSC具有成骨分化能力。

2.3 鼠尾淋巴水腫模型

模型制備后3 d，鼠尾開始明顯增粗，直到術(shù)后3周，鼠尾直徑達(dá)到最大并保持穩(wěn)定。30 d后，鼠尾直徑逐漸下降，至70 d時鼠尾創(chuàng)面恢復(fù)。實驗組與對照組經(jīng)配對t檢驗，P>0.05，無顯著差異（圖2）。

2.4 鼠尾淋巴管熒光示蹤

移植后1個月，鼠尾淋巴管熒光造影顯示注射區(qū)呈綠色，迂曲的淋巴管顯示為黃色，說明移植入的細(xì)胞貼附到了淋巴回流的通道。對照組則無該現(xiàn)象（圖 3）。

圖1 小鼠原代ADSCs培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察和成骨誘導(dǎo)檢測（倒置相差顯微鏡，40×）Fig.1 Morphology observation of primary passage of mouse ADSCs and detection of osteogenic induction(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖2 鼠尾淋巴水腫模型在60 d內(nèi)的形態(tài)變化Fig.2 The morphology of the lymphedema model on mouse tail

圖3 鼠尾淋巴水腫模型阻塞區(qū)淋巴管熒光造影Fig.3 Fluorescence micro-lymphangiography of the mouse tail in the lymphedema model on mouse tail

3 討論

ADSC在缺血等低氧刺激下可以表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，同時具備血管內(nèi)皮的部分功能[3]；也有研究發(fā)現(xiàn)，ADSC可以分泌內(nèi)皮生長因子與肝細(xì)胞生長因子，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管新生[4]；Cai等[5]發(fā)現(xiàn)，干擾ADSC分泌肝細(xì)胞生長因子，會影響其修復(fù)血管損傷的能力。鑒于淋巴循環(huán)與血液循環(huán)具有同源性，我們假設(shè)ADSC也可用于修復(fù)損傷的淋巴管。

經(jīng)典的淋巴水腫動物模型有很多種，如犬后肢、兔后肢、兔耳等。我們選擇鼠尾淋巴水腫模型是因為該動物模型可復(fù)制性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、操作相對容易。但由于低等動物的淋巴管再生能力強(qiáng)，大部分種系的鼠尾淋巴水腫模型僅能夠維持20～30 d，而部分品系老鼠維持時間較久，如C57小鼠可維持60～70 d左右，選擇此種小鼠模型能更好地觀察淋巴管損傷修復(fù)的過程和各實驗因素的影響。同時，由于時間窗的存在，鼠尾模型更多的被用于觀察急性淋巴管損傷后的病理變化，如膠原、淋巴管再生、異常的皮內(nèi)脂肪堆積等。本實驗中，我們利用鼠尾自身淋巴管再生的時間段，研究ADSC是否參與該再生過程。

近期有多項研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-c作用于其特異性受體VEGFR-3，可以促進(jìn)淋巴管再生，如將重組人VEGF-c注射入鼠尾淋巴水腫模型，發(fā)現(xiàn)水腫消退加快；在注射抗VEGFR-3的單克隆抗體后，VEGF-c的治療作用下降[6]。本實驗結(jié)果顯示，ADSC植入后，水腫消退速度沒有明顯加快。我們認(rèn)為原因可能是：①鼠尾皮下組織致密，細(xì)胞植入后易聚集，與組織接觸面少，難以存活，故我們采用少量反復(fù)注射的方法；②實驗中發(fā)現(xiàn)部分C57小鼠水腫期可達(dá)70 d以上，形成慢性淋巴水腫；③細(xì)胞之間及其與機(jī)體之間的相互作用復(fù)雜，不利因素難以排除。

但我們發(fā)現(xiàn)，ADSC可以貼附于淋巴液回流的通道。在組織間隙，從毛細(xì)血管漏出的蛋白通過間質(zhì)液體流回流入淋巴管系統(tǒng)。此間質(zhì)液體流可攜帶與淋巴系統(tǒng)相關(guān)的生長因子和蛋白酶，從鼠尾遠(yuǎn)心端流入近心端。其中，蛋白酶可以分解組織，形成不規(guī)則的、迂曲的間質(zhì)液體流經(jīng)過的通道，此通道可看作為前淋巴管；間質(zhì)液體流所攜帶的VEGF-c所形成的梯度，可以引導(dǎo)淋巴內(nèi)皮遷移，從而形成淋巴管，完成淋巴循環(huán)的重建[7-8]。本研究中，我們觀察到ADSC形成了這一間質(zhì)液體流回流通道，但ADSC通過分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞來參與修復(fù)，還是分泌相關(guān)因子促進(jìn)了殘存的內(nèi)皮細(xì)胞或骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞參與再生，尚需進(jìn)一步研究。

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