胡 薇 孟星宇 田玉華 劉 寧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

鹿茸是鹿的第二性征，是在一定生理條件下額骨部長出的骨質(zhì)性組織，其生長發(fā)育受特定的分子機(jī)理調(diào)控。即鹿茸的獨特之處就在于它的每年更新，這在哺乳動物中絕無僅有，因而其成為研究器官再生的理想模型［1－2］。鹿茸生長速度為每天1～2 cm，是任何哺乳動物組織和器官無法比擬的，其相應(yīng)表皮層也生長很快，以便覆蓋新增長的骨質(zhì)［3］。因此，人們推測其中可能存在特殊的促進(jìn)骨和上皮組織快速生長的活性物質(zhì)，控制并刺激鹿茸的生長。早在1991年，新西蘭學(xué)者Suttie等［4］就發(fā)現(xiàn)，一種對多種細(xì)胞和組織增殖具有刺激作用的多肽類物質(zhì)——胰島素生長因子(insulin－like growth factor，IGF)，可能是促進(jìn)鹿茸生長的刺激因子。其中，IGF1和IGF2是有效的促進(jìn)骨細(xì)胞分裂劑，但I(xiàn)GF2對成骨細(xì)胞的作用較 IGF1 弱［4］。Rosen［5－6］等學(xué)者也證明 IGF1 在體內(nèi)有促進(jìn)骨形成的作用。因此，IGF1既可促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成作用，又可促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收作用，在骨重建過程中起著重要作用。目前，已從許多動物體組織中分離得到IGF1，并且各類動物的IGF1基因序列和氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中均可以檢索到。但是，未見有關(guān)東北梅花鹿IGF1基因全長cDNA方面的報道，而IGF1mRNA的表達(dá)調(diào)控研究更少。但由于mRNA水平的定量檢測是反映IGF1合成、分泌最直接、最靈敏的途徑，對進(jìn)一步研究IGF1的功能具有重要的促進(jìn)作用。因此，本研究旨在通過梅花鹿IGF1基因編碼區(qū)全長cDNA的克隆與序列分析，以及利用相對熒光定量Real Time PCR技術(shù)檢測鹿茸頂端組織IGF1基因的mRNA表達(dá)水平，為深入研究IGF1的功能及對鹿茸生長的調(diào)節(jié)作用提供可參考的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮東北梅花鹿鹿茸于2010年6月采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗鹿場1頭3歲左右的健康雄鹿，保存于液氮中帶回實驗室備用。TRIzoL試劑購自Invitrogen公司，pMD－18T vector、Ex Taq DNA聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ、DL－2000 Marker購自 TaKaRa公司，Real Master Mix購自長春寶泰克公司。

1.2 樣品制備

根據(jù)組織結(jié)構(gòu)和生長特點，將鹿茸頂端組織大致分為真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層［7］。使用消毒處理過的手術(shù)刀在離鹿茸頂端4 cm處沿垂直鹿茸生長軸方向切斷，切取真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層組織各100 mg，于液氮中保存。

1.3 鹿茸頂端組織總RNA提取與雙鏈cDNA的獲得

按照Trizol操作手冊分別提取真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層樣品總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光法檢測總RNA質(zhì)量。以提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo－dT為引物，以逆轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。

1.4 IGF1基因全長cDNA克隆與序列分析

參照GenBank中相關(guān)序列，設(shè)計IGF1基因特異性引物(上游引物:ATGGGAAAAATCAGCAGTCTT和下游引物:CTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCT)，以軟骨組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物連接到pMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，涂板并于37℃培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒并將鑒定正確的重組質(zhì)粒送TaKaRa公司測序。獲得的梅花鹿IGF1基因序列遞交GenBank(登錄號:HQ890468)。并將測序結(jié)果分別與GenBank中馬鹿(EF_157842)、牛(NM_001077828)、羊(NM_001009774)、馬(EU018459)、豬(DQ784687)、人(NM_000618)和小鼠(NM_001111275)的序列進(jìn)行同源性分析。

1.5 相對熒光定量PCR法檢測IGF1基因在鹿茸頂端組織的表達(dá)豐度

合成用于IGF1基因的特異引物(上游引物5＇－TGTGATTTCTTGAAGCAGGTGA －3＇和下 游引物 5＇－ CGTGGCAGAGCTGGTGAAG－3＇)，擴(kuò)增片段長度為96 bp。以鹿的持家基因actin(GenBank登錄號:AY345228)作為內(nèi)參基因，合成actin引物(上游引物5＇－TGACCCTTAAGTACCCCATCGA－3＇和下游引物 5＇－ TTGTAGAAGGTGTGGTGCCAGAT －3＇)，擴(kuò)增片段長度為85 bp。IGF1探針序列為(5＇－TGCCCGTCACATCCTCCTCGC – 3＇)。

以鹿茸組織cDNA為模版，PCR分別擴(kuò)增IGF1和actin。PCR 體系:cDNA 模板6.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，PCR Mix 15 μL，ddH2O 3.0 μL，總體積為 25 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行30 個循環(huán)。采用Real Master Mix試劑和7500 Real Time PCR System分析IGF1基因在真皮、間充質(zhì)、前軟骨和軟骨組織中的表達(dá)豐度。Real－time PCR體系:1 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，上下游引物各 5 pmol，10 μL real Master Mix，總體積為 25 μL。反應(yīng)條件:94℃激活DNA聚合酶2 min;94℃變性20 s;60℃復(fù)性30 s;68℃延伸45 s;進(jìn)行40個循環(huán)。隨后做PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線分析，使用StepOne Software v2.1軟件分析IGF1相對內(nèi)參actin基因的差異表達(dá)Ct值(Ct為熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸頂端組織總RNA的提取

各樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，28 S、18 S和5 S 3條帶清晰可見(圖1)，表明所提取的鹿茸真皮、間充質(zhì)、前軟骨和軟骨組織總RNA質(zhì)量符合定量PCR分析用標(biāo)準(zhǔn)，未發(fā)生RNA明顯降解。

2.2 IGF1基因的全長cDNA克隆

IGF1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳得到約465 bp的1條特異性條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。提取重組質(zhì)粒，用XbaI和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pMD－18T－IGF1(圖3)，從圖3中可看出，可獲得與目的帶大小相符的電泳條帶465 bp，表明克隆基本成功。

圖1 鹿茸頂端組織總RNA提取結(jié)果

圖2 IGF1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pMD－18T－IGF1雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 IGF1基因的全長cDNA序列分析

梅花鹿IGF1基因與GenBank中馬鹿、牛、羊、馬、豬、人和小鼠的核苷酸和氨基酸序列Blast分析結(jié)果顯示:梅花鹿IGF1基因編碼區(qū)全長cDNA為465 bp，其中與馬鹿、牛和羊的序列同源性最高，核苷酸序列同源性分別為99.78%、98.28%和97.85%(圖4);氨基酸序列同源性分別為 99.35%、98.05%和97.40%(圖5)，肽鏈長度均為154個氨基酸;而馬、豬、人和小鼠4個物種IGF1的核苷酸序列為462 bp，肽鏈長度皆為153個氨基酸。

圖4 梅花鹿、馬鹿、牛、羊、馬、豬、人及小鼠IGF1基因核苷酸序列分析結(jié)果

圖5 梅花鹿、馬鹿、牛、羊、馬、豬、人及小鼠IGF1氨基酸序列分析結(jié)果

2.4 IGF1基因在鹿茸頂端組織中的表達(dá)豐度

以鹿茸頂端組織cDNA為模版，PCR分別擴(kuò)增actin和IGF1。actin擴(kuò)增長度為85 bp，IGF1擴(kuò)增片段長度為96 bp，見圖6。利用Real time PCR的方法，使用梅花鹿actin作為內(nèi)源參照基因，每個樣本做3個重復(fù)，檢測IGF1基因在鹿茸組織不同部位的表達(dá)豐度。圖7為IGF1基因相對熒光定量PCR擴(kuò)增曲線，從圖中可看出，熒光定量動力學(xué)曲線指數(shù)區(qū)明顯，斜率較大且固定，應(yīng)為較理想的擴(kuò)增曲線，說明熒光定量PCR方法檢測的結(jié)果具有較好的靈敏性和準(zhǔn)確性。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在鹿茸頂端組織不同部位IGF1基因mRNA表達(dá)水平存在明顯的表達(dá)差異，間充質(zhì)、真皮、前軟骨和軟骨組織中IGF1基因的表達(dá)量呈遞增趨勢，見表1。

圖6 IGF1和actin的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

近年來，許多學(xué)者利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織胚胎學(xué)等技術(shù)從基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等角度研究了鹿茸再生問題，特別是鹿茸軟骨骨化過程的組織學(xué)特性已經(jīng)得到深入研究［8］。但關(guān)于鹿茸發(fā)育的分子機(jī)理，至今仍不十分清楚。而胰島素樣生長因子等細(xì)胞因子對鹿茸生長的作用還缺乏詳細(xì)的基礎(chǔ)試驗數(shù)據(jù)。已知IGFs包括IGF1和IGF2，是由70個氨基酸組成的具有內(nèi)分泌、自分泌及旁分泌特性的單鏈多肽，對機(jī)體生長發(fā)育起著重要調(diào)節(jié)作用［9－10］。IGFs能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖，對鹿茸的生長起重要作用，目前已經(jīng)得到學(xué)者的普遍認(rèn)可［11－12］，但由于其調(diào)控機(jī)理非常復(fù)雜，并且對IGF1基因mRNA的表達(dá)調(diào)控研究相對較少，這在一定程度上也反映出國內(nèi)外對于該領(lǐng)域的研究較為緩慢。

圖7 IGF1基因的PCR擴(kuò)增曲線

近來許多動物和人的IGF1已經(jīng)研究得較透徹，但Gen－Bank中關(guān)于鹿類生長因子基因序列的檢索較少，梅花鹿IGF1基因編碼區(qū)全長cDNA尚未得到克隆。本文根據(jù)馬鹿、牛和羊的IGF1基因序列設(shè)計引物，通過RT－PCR技術(shù)克隆了IGF1基因cDNA全部編碼序列，并獲得GenBank登錄號。其開放閱讀框為465 bp，該序列與其它7個物種的IGF1核苷酸序列高度同源，其中與馬鹿的IGF1核酸序列同源性最高;氨基酸序列同源性分析顯示:梅花鹿IGF1基因共編碼154個氨基酸，與馬鹿、牛和羊IGF1肽鏈的結(jié)構(gòu)完全一致，其它4個物種馬、豬、人和小鼠IGF1肽鏈為153個氨基酸，這說明IGF1進(jìn)化非常保守。在梅花鹿IGF1氨基酸序列中具有與其它7個物種相同的6個保守的半胱氨酸殘基，可形成3個二硫鍵，這對于維持IGF1的空間結(jié)構(gòu)起到關(guān)鍵作用。

表1 鹿茸頂端不同組織IGF1基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果(n=3±s)

表1 鹿茸頂端不同組織IGF1基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果(n=3±s)

注:Ct代表熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù);2－ΔΔCt2代表目的基因相對于內(nèi)參基因的定量。

頂端組織actin擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct1)IGF1擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct2)相對定量結(jié)果(2 －ΔΔCt2)以間充質(zhì)表達(dá)量為1標(biāo)準(zhǔn)化間充質(zhì)11.470 ±0.156 1 25.268 ±0.317 0 0.000 1 1.000真 皮 17.239 ±0.115 0 28.724 ±0.367 5 0.000 3 4.969前軟骨 17.861 ±0.144 7 28.300 ±0.262 0 0.000 7 10.260軟 骨17.953 ±0.424 0 27.912 ±0.164 8 0.001 0 14.310

檢測基因表達(dá)水平的方法有Northern雜交、原位雜交和定量PCR等多種方法，但這些方法很難對起始模板準(zhǔn)確定量。熒光定量PCR技術(shù)不僅達(dá)到了PCR從定性到定量的飛躍，而且它具有特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點成為基因工程研究中的重要工具［13］。本文利用 Real time PCR方法，以梅花鹿actin作為內(nèi)源參照基因，對梅花鹿IGF1在鹿茸頂端4種不同組織進(jìn)行了表達(dá)水平分析。結(jié)果表明:IGF1在檢測的所有組織中均有不同程度的表達(dá)，該結(jié)果具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，且檢測結(jié)果用拷貝數(shù)來表示起始模板的含量，相對半定量RT－PCR中的比較值更為準(zhǔn)確可靠。同時分析發(fā)現(xiàn):IGF1在軟骨和前軟骨組織中表達(dá)量最高，真皮層和間充質(zhì)層中表達(dá)量較低。已有研究提示:在鹿茸快速生長期，IGF1對軟骨生長過程的影響較大，軟骨組織骨化速度超過茸皮層組織生長速度，這進(jìn)一步說明IGF1是鹿茸再生過程中軟骨生長的主效因子之一?？傊?，本文只是針對IGF1基因在東北梅花鹿這個物種上進(jìn)行了初步的研究，獲得可供參考和利用的基礎(chǔ)試驗數(shù)據(jù)，但要將IGF1的功能研究透徹，還需今后國內(nèi)外學(xué)者大量的實驗研究去證實。

［1］Kierdorf U.Deer antler regeneration:cells，concepts，and controversies［J］.J Morphol，2007，268(8):726 －738.

［2］鮑加榮，楊福合，榮敏，等.鹿茸發(fā)育研究進(jìn)展［J］.特產(chǎn)研究，2008(2):64－67.

［3］郝麗，李和平，嚴(yán)厲.東北梅花鹿鹿茸尖端組織全長cDNA文庫的構(gòu)建［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，37(11):120 －122.

［4］Suttie J M，White R G，Breier B H，et al.Photoperiod associated changes in insulin－like growth factor－1 in reindeer［J］.Endocrinology，1991，129(2):679 －682.

［5］Rosen H N，Chen V，Cittadin A，et al.Treatment with growth hormone and IGF－1 in growing rats increase bone mineral content but not bone mineral density［J］.Bone Miner Res，1995，10(9):1352－1358.

［6］Boudignon B M，Bikle D D，Kurimoto P，et al.Insulin－like growth factor I stimulates recovery of bone lost after a period of skeletal unloading［J］.J Appl Physiol，2007，103(1):125 － 131.

［7］Li C，Suttie J M.Tissue collection methods for antler research［J］.Eur J Morphol，2003，41(1):23 －30.

［8］Li Chunyi，Suttie J M，Clark D E.Histological examination of antler regeneration in red deer(Cervus elaphus)［J］.The Anatomical Record Part A，2005，282A(2):163 －174.

［9］Rosen C J，Pollak M.Circulating IGF －1:New perspectives for a new century［J］.Trends in Endocrinology and Metabolism，1999，10(4):136－141.

［10］Price J，Allen S.Exploring the mechanisms regulating regeneration of deer antlers［J］.Philosophical Transactions of the Royal Society of B，2004，359(5):809 －822.

［11］崔昊震，尹明浩.鹿茸生長因子的研究現(xiàn)狀［J］.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2006，29(1):70 －72.

［12］馮海華，閉興明，趙麗紅，等.胰島素樣生長因子1對不同生長時期鹿茸生長中心細(xì)胞體外增殖的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，37(11):7373 －7376.

［13］趙煥英，包金風(fēng).實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2007，16(4):492－497.