張 巖 王玉成 吳英杰 王 超

(林木遺傳育種與生物技術教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

木聚糖內(nèi)糖基轉移酶(xyloglucan endotransglycosylase，XET)是所有植物細胞壁重建過程中的一個關鍵酶，它利用轉糖基機制在植物細胞壁中進行木聚糖多聚體的切割和組裝［1］。在研究豌豆莖的伸長時發(fā)現(xiàn)，木聚糖鏈的酶切斷裂，可使細胞壁膨脹疏松，促進細胞生長［2］。Nishitani首次純化了XET蛋白［3－4］，XET一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便在細胞分化、擴展和特化等多方面受到重視，有人甚至認為它可能是植物生長機制中的核心酶。目前已經(jīng)從擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、蕃茄(Solanum lycopersicum)、小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)等作物中分離出10多個XET基因成員，分別有不同的功能。陳昆松等［5］在用外源乙烯處理誘導獼猴桃軟化的過程中發(fā)現(xiàn)XET活性快速增加，促進了細胞壁的膨脹疏松。Lu等［6］在香蕉果實軟化過程中發(fā)現(xiàn)MA－XETI與香蕉果肉軟化相關，并且與果皮的硬度密切相關。近些年，XET活性與木質(zhì)部生長關系的研究逐漸受到重視。Israelsson等［7］對過量產(chǎn)生GA的轉基因植株檢測分析表明，增加木材形成速率的酶中就包括XET。桉樹中實時RT－PCR分析表明，XET在次生木質(zhì)部的表達水平是在葉子中表達的360倍，這說明了在次生木質(zhì)部細胞壁的形成中XET蛋白起著重要作用［8］。與韌皮部相比，XET在擬南芥木質(zhì)部有大量的表達，表明在木質(zhì)部組織中，XETs可能參與了木葡聚糖鏈的移位使木質(zhì)部細胞膨脹［9］。

白樺(Betula platyphyllaSuk.)為樺木科樺木屬植物，是目前較為廣泛應用的紙漿材樹種之一。研究其次生細胞壁形成過程中的相關基因，對改良白樺的紙漿材特性具有重要的意義。筆者從白樺形成層相關組織cDNA文庫中克隆得到了白樺XET基因全長cDNA序列，并對其進行了序列分析及蛋白質(zhì)高級結構預測，利用Semi－quantative RT－PCR方法分析了該基因在根莖葉不同器官的表達情況，為進一步研究白樺XET基因的功能奠定基礎。

1 試驗方法

1.1 白樺XET基因的克隆和序列分析

本研究構建了白樺形成層相關組織cDNA文庫，對文庫克隆進行隨機測序，運用NCBI的BLASTX和BLASTN程序對獲得的序列進行同源性比對，獲得XET的全長cDNA序列。

利用NCBI ORF Finder確定XET基因的開放讀碼框;利用NCBI的BlastP尋找保守區(qū)，預測蛋白所屬家族;用ProtParam(http://au.expasy.org/cgi－bin/protparam)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì);用BlastX尋找相似性序列，并選擇與其相似性較高的另外7種植物的XET蛋白氨基酸序列，用多序列聯(lián)配程序ClustalX(1.83)進行多序列比對，構建XET基因進化樹。

利用ProtScale軟件、HNN軟件等在線分析α－螺旋、β－轉角、無規(guī)卷曲以及延伸連等蛋白的二級結構;利用網(wǎng)站http://au.expasy.Org/tools/中的 Swiss－Model程序進行同源建模，預測XET蛋白的空間結構。

1.2 sqRT－PCR鑒定XET基因在不同器官的表達

培養(yǎng)白樺組培苗［10］。選取生長旺盛的單株，洗去培養(yǎng)基，吸干水分。于根、莖、葉3個部位取材，液氮處理，置于冰箱中－80℃保存。

CTAB法提取白樺根、莖、葉總RNA，經(jīng)DNaseI(Promega)消化處理，去除DNA污染。取1 μg總RNA進行反轉錄，反轉錄反應體系和操作參照PrimerScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)。將反轉錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作sqRT－PCR的模板。選擇TUB作為內(nèi)參基因。內(nèi)參和XET基因的定量PCR引物如表1所示。

表1 sqRT－PCR引物序列

sqRT－PCR 反應體系:10×Buffer 2 μL，dNTP(2.5 μmol/L)0.4 μL，上、下游引物各 1 μL(20 μmol/L)，TaqDNA Polymerase 0.25 μL，cDNA 2 μL，去離子水補至20 μL，設置3 次重復。PCR反應程序:94℃預變性3 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)30次，72℃延伸7 min。反應產(chǎn)物利用1%EB－瓊脂糖凝膠電泳檢測。運用Quantity One Analysis Software對電泳結果相對定量，通過調(diào)整上樣量使內(nèi)參均一化，按照調(diào)整后內(nèi)參的上樣量分析XET基因的表達量，進而用Quantity One Analysis Software得出定量分析的數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 白樺XET基因全長cDNA的獲得及序列分析

通過對白樺形成層相關組織cDNA文庫隨機測序和序列比對分析，獲得白樺XET基因全長cDNA序列。該cDNA編碼區(qū)序列自74位的ATG起，止于954位的TAG，全長882 bp，見圖 1。3＇UTR 135 bp，5＇UTR 73 bp。開放讀碼框編碼由 293個氨基酸殘基組成的多肽，編碼蛋白的分子質(zhì)量為33.1 ku，理論等電點為5.49，為酸性蛋白質(zhì);負電荷殘基(Asp+Glu)數(shù)為34，正電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為23個;不穩(wěn)定系數(shù)為29.32，為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

圖1 白樺XET基因序列及由此推導的氨基酸序列

2.2 白樺XET蛋白家族預測

利用NCBI的BlastP尋找保守區(qū)，結果表明白樺XET基因具有一個保守區(qū)，屬于糖基水解酶16超家族，見圖2。利用Pfam程序找到一個XET C－terminu超家族的保守區(qū)。

2.3 XET多序列比對及進化樹

對XET基因進行BlastX比對分析，發(fā)現(xiàn)各物種間該基因的蛋白質(zhì)序列相似度較高，選取8種植物XET蛋白的氨基酸序列，運用Clustalx(1.83)進行多序列比對，并創(chuàng)建進化樹，如圖3、圖4所示。從圖中可以看出，各物種的XET蛋白質(zhì)序列相對保守，但是N端序列保守性不高，這與蛋白家族保守區(qū)預測的結果相似，該基因的大部分序列位于保守區(qū)內(nèi)。進化樹分析得出，白樺XET基因與楊樹(Populus tremula)、蓖麻(Actinidia deliciosa)XET基因的同源性較其他物種高。

圖2 BlastP推導的XET氨基酸序列的保守區(qū)預測

圖3 8個物種XET蛋白的多序列比對分析

圖4 XET基因進化樹

2.4 白樺XET蛋白二級結構

運用ExPASy Proteomics tools中的SOPMA軟件在線分析XET蛋白的二級結構，如圖5所示。組成白樺XET蛋白的293個氨基酸中，25個氨基酸可能形成α－螺旋，104個氨基酸可能形成延伸，147個氨基酸可能形成無規(guī)卷曲，17個氨基酸可能形成β－轉角。

2.5 白樺XET蛋白三級結構

通過在ExPDB晶體圖像數(shù)據(jù)庫中(http://www.rcsb.org/pdb/)搜索相似的序列，得到一個同源性較高的蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)。以此序列的結構信息為原子模型登錄Swiss－Model服務器上進行結構排列，并運用結構仿真模擬(ProModⅡ程序)和能量最小化分析(GROMOS96程序)構建目標序列的結構［11－13］，模建結果見圖 6。利用 Swiss－viewer3.7 對模建結果進行檢測，計算得出Ramachandran圖(圖7)，由圖可見，模擬得到的白樺XET蛋白三維結構的Φ角和Ψ角有95%位于Ramachandran圖中合理區(qū)域，從理論上表明此三維結構是可靠的。

圖5 白樺XET蛋白的二級結構分析

圖6 白樺XET蛋白的空間結構

圖7 Ramachandran圖

2.6 白樺XET基因在不同器官的表達

通過sqRT－PCR方法分析白樺XET基因在根莖葉3個器官的表達情況，首先對內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的電泳結果進行定量，通過調(diào)整上樣量，使內(nèi)參基因表達量均一化，然后依據(jù)調(diào)整后的上樣量對相應的XET基因PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，如圖8;運用Quantity One Analysis Software對電泳結果進行相對定量，結果顯示，XET基因在根、莖和葉3個器官內(nèi)都有較高的表達水平，其中在莖中表達量最高，在葉中表達量相對最低。

圖8 白樺XET基因在不同器官的表達

3 結論與討論

XET能夠催化木聚糖鏈的裂解來使細胞壁松弛，在調(diào)節(jié)細胞分化、擴展和重構過程中起作用，進而調(diào)節(jié)果實軟化和木質(zhì)部發(fā)育等，屬于糖基水解酶家族的一員。糖基水解酶家族是一組廣泛存在的，水解兩個或更多碳水化合物之間或者碳水化合物和非碳水化合物半族之間糖苷接點的酶。本文在XET蛋白家族預測中找到了一個糖基水解酶超家族的保守區(qū)和XET C－terminu超家族保守區(qū)，確定所獲得基因為XET基因。運用同源模建方法，以原子質(zhì)量為1 μ序列的結構信息為原子模型，構建了白樺XET基因編碼蛋白的三維結構，并利用Swiss－viewer 3.7對模建結果進行檢測，計算得出Ramachandran圖。Ramachandran圖是反映立體化學質(zhì)量(stereochemical quality)的參數(shù)，它通過分析Φ角和Ψ角的分布方式大致評估模擬的結構是否與自然結構趨勢相同。黃色區(qū)域是最理想的Φ角和Ψ角分布區(qū)域，而藍色區(qū)域外部則為不合理區(qū)域［14］。由圖7可見，模擬得到的白樺XET蛋白的三維結構的Φ角和Ψ角有95%位于Ramachandran圖中合理區(qū)域，從理論上表明該XET蛋白的三維結構是可靠的。序列決定功能，這為今后研究白樺XET蛋白結構和生物學功能奠定了基礎。

細胞壁的形態(tài)建成是一系列酶作用的結果，尤其是細胞壁修飾酶，有研究表明XET蛋白就是一類重要且與細胞伸長密切相關的細胞壁松弛酶。植物細胞初生細胞壁的形成是由同步生長和嵌入生長共同決定的，此時，編碼細胞壁修飾酶類的基因會大量表達。有研究表明，楊樹中16個XET基因在發(fā)育的木質(zhì)部中表達，其中5個高度表達，1個在木質(zhì)部中特異表達［15］。XET基因在楊樹應壓木中表達量升高，說明其參與了次生細胞壁形成的生理程序［16］。本研究通過sqRT－PCR方法分析了白樺XET基因在生長中苗木不同器官的表達情況，結果顯示，XET在根，莖和葉中都有較高的表達水平，說明生長中的根、莖和葉組織正在進行細胞的形態(tài)建成，XET在白樺這3種組織的細胞壁建成過程中發(fā)揮了作用。此XET基因在白樺根和莖中的表達水平高于葉組織，而且Chao Wang等［17］研究發(fā)現(xiàn)此白樺XET基因在形成層發(fā)育的不同時期具有時序性表達特性，推測此XET基因與維管組織次生細胞壁的建成有關。

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