高國(guó)輝，黃奇迪，王金丹，楊水兵，楊娟，張鳳立，胡孝渠

（1.溫州醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腫瘤外科，浙江溫州 325000；3.溫州醫(yī)學(xué)院 仁濟(jì)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

人表皮生長(zhǎng)因子受體2（the human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是定位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的癌基因[1]，該基因的表達(dá)狀態(tài)與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，是典型的惡性腫瘤標(biāo)志物。目前，以HER2為靶標(biāo)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向生物治療是臨床腫瘤治療的熱點(diǎn)之一[2-4]。

抗HER2單鏈抗體片段（anti-HER2 single chain fragment variable，anti-HER2 ScFv）是抗HER2免疫球蛋白Fab片段中的可變區(qū)部分，其分子小、穿透實(shí)體瘤能力強(qiáng)、靶向特異性明顯。研究表明，將Anti-HER2 ScFv與其他腫瘤細(xì)胞殺傷性多肽重組，構(gòu)建融合蛋白用于藥物靶向性研究將具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值[5-7]。 但是，這些融合蛋白靶向結(jié)合HER2的結(jié)果驗(yàn)證大多需要間接免疫法或流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)判斷最終結(jié)果，鑒定步驟較多，誤差大。

本研究擬以綠色熒光蛋白（green fluorecent protein，GFP）為報(bào)告基因，構(gòu)建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP，在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得攜帶綠色熒光蛋白的抗HER2單鏈抗體，觀(guān)察該融合單鏈抗體結(jié)合乳腺癌細(xì)胞表面受體后活細(xì)胞表面綠色熒光的分布，分析其應(yīng)用于靶向治療HER2陽(yáng)性腫瘤和分子診斷的可能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因片段、菌種與載體：鼠源性人抗HER2-ScFv片段由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院宋爾衛(wèi)教授課題組提供，GFP片段由浙江大學(xué)生命科學(xué)院吳敏教授惠贈(zèng)，大腸桿菌E.coliTG1、E.coliTOP10、原核表達(dá)載體pBAD His B由本實(shí)驗(yàn)室保存， pGEM T easy Vector購(gòu)于Promega公司。

1.1.2 主要試劑：T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTP、中分子量蛋白Marker、NC膜購(gòu)于Promega公司，限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、HindIII、BamHI、dNTPs、DNA Marker DL2000、DNA Marker 4500均為T(mén)akara公司產(chǎn)品；鼠抗GFP-Tag mAb、Goat Anti-Mouse IgG-HRP、DAB為ABMART公司產(chǎn)品，DNA Gel PurfiicatoinKti3.1為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成：見(jiàn)表1。

表1 PCR引物名稱(chēng)及序列

1.2.2 融合基因anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建：PCR法分別獲得目的基因anti-HER2-ScFv、GFP，用EcoRI、Bam HI雙酶切anti-HER2-ScFv基因片段，用Hind III、Bam HI雙酶切基因片段GFP，分別膠回收之。將兩條同時(shí)具有Bam HI黏性末端膠回收片段產(chǎn)物利用T4DNA連接酶16 ℃連接過(guò)夜，以連接產(chǎn)物為模板，以anti-HER2-ScFv-F為上游引物，GFPR為下游引物，PCR擴(kuò)增獲得融合基因，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定之。將之克隆到pGEM T easy Vector，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性篩選，構(gòu)建供體質(zhì)粒pGEM T easy Vector/anti-HER2-ScFv-GFP，測(cè)序鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒中融合基因序列，Blast比對(duì)序列的正確性。

1.2.3 原核表達(dá)載體重組子pBAD His B/anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建：用EcoR I、HindIII分別雙酶切供體質(zhì)粒pGEM T easy Vector/anti-HER2-ScFv-GFP，原核表達(dá)載體pBAD His B，用T4DNA連接酶將pBAD His B與anti-HER2-ScFv-GFP在4 ℃連接反應(yīng)過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性篩選，藍(lán)白斑篩選、雙酶切鑒定重組子，提取陽(yáng)性重組子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，鑒定之。

1.2.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：挑取單克隆，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日以1:100接種，37 ℃培養(yǎng)至A600 nm達(dá)0.6左右，加0.2%濃度L-阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑，37 ℃，150 r/min，分別誘導(dǎo)0、3、5 h，吸取1.5 mL菌液離心沉淀菌體，用100μL 1×PBS重懸菌體待用。

1.2.5 SDS-PAGE與Western Blot分析：將菌液加等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer沸水浴煮沸5 min后，12000 r/min離心5 min取上清，以0 h誘導(dǎo)的重組菌與空載體菌株為陰性對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE分析。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜，以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次加入鼠抗GFP Tag mAb（1:5000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜）為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1:5000稀釋?zhuān)覝? h）為二抗用化學(xué)發(fā)光試劑盒于暗室條件下感光顯影，分析蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化與濃度測(cè)定：取200 mL誘導(dǎo)菌離心后收集菌體，用100 mmol/L Tris·HC1（pH 8.0）重懸，冰浴中溫和超聲6次（每次2 min，間隔10 s）破碎菌體，4 ℃，10000 r/min，離心5 min，收集上清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)利用Ni2+-NTA親和層析法純化之，各取少量不同組洗脫液加入等量2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸5 min，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。透析法和稀釋法反復(fù)復(fù)性， 取合適體積的純化融合蛋白樣品考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，以牛血清血蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)所測(cè)定的A595nm，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）。

1.2.7 融合蛋白結(jié)合HER2陽(yáng)性細(xì)胞株SKBR3與HER2陰性細(xì)胞株MCF7功能的分析：過(guò)0.45μm濾膜對(duì)純化后的融合蛋白除菌，胰酶消化生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)的乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MCF7，重懸于無(wú)胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，分別滴入不同稀釋度的融合蛋白樣品（1:5、1:20、1:40），37 ℃， 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，調(diào)整細(xì)胞密度為5×108個(gè)/L，以1 mL/孔加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，設(shè)復(fù)孔為陰性洗脫對(duì)照，使anti-HER2-ScFv與乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MCF7細(xì)胞表面受體充分結(jié)合，添加胎牛血清含100 mL/L，37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，1×PBS洗3次。以GFP標(biāo)準(zhǔn)品為陰性對(duì)照，激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察綠色熒光單鏈抗體與SKBR3、MCF7細(xì)胞表面受體結(jié)合情況，分析細(xì)胞的變化。

2 結(jié)果

2.1 融合基因anti-HER2-ScFv-GFP的獲得 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定表明anti-HER2-ScFv（816 bp）在800 bp左右，GFP（720 bp）為700 bp左右，如圖1A所示，融合基因anti-HER2-ScFv-GFP在1539 bp左右，如圖1B所示，與預(yù)計(jì)相符合。

圖1 融合基因的構(gòu)建過(guò)程圖

對(duì)pGEM T easy Vector/anti-HER2-ScFv-GFP測(cè)序，表明anti-HER2-ScFv片段處于融合基因上游，其3’端終止密碼子TAA在PCR擴(kuò)增時(shí)成功刪除，全長(zhǎng)813 bp。GFP片段處于融合基因下游，全長(zhǎng)為720 bp，兩片段由6 bp的BamHI酶切位點(diǎn)的互補(bǔ)黏性末端處直接連接，整個(gè)融合基因?yàn)?539 bp。Blast分析重組子中的融合基因序列與理論序列同源性為100%。

2.2 原核表達(dá)載體重組子pBAD His B/anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定表明，雙酶切結(jié)果在1500 bp左右有明顯條帶出現(xiàn)，EcoR I單酶切在4500 bp以上有明顯條帶出現(xiàn)，如圖2A所示，PCR擴(kuò)增出1539 bp條帶如圖2B，表明原核表達(dá)載體pBAD His B/anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建成功。

圖2 原核表達(dá)載體重組子pBAD His B/anti-HER2-ScFv-GFP的構(gòu)建

2.3 SDS-PAGE和Western Blot鑒定 SDS-PAGE結(jié)果如圖3A所示。在55～72 kDa之間有明顯特異性條帶，與預(yù)計(jì)的融合蛋白60 kDa左右一致。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜，Western Blot結(jié)果有特異性條帶在60 kDa左右，如圖3B。

圖3 SDS-PAGE法和Western Blot法鑒定原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的融合蛋白

2.4 融合蛋白的復(fù)性與濃度的測(cè)定 取1:10稀釋后的純化融合蛋白Anti-HER2-ScFv-GFP樣品，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，所測(cè)定的A595nm=0.487，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)濃度約為492.8 μg/mL。

2.5 融合蛋白靶向結(jié)合SKBR3與MCF7的功能分析 以1:5、1:20、1:40不同濃度梯度稀釋后，滴定于SKBR3和MCF7，48 h后分別用1×PBS洗脫，結(jié)果HER2陰性的乳腺癌細(xì)胞MCF7上的熒光單鏈抗體很容易被洗脫（圖4B），而HER2陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞SKBR3上的熒光單鏈抗體不被洗脫，SKBR3細(xì)胞出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞變小，增殖變慢（圖4A）。GFP作為陰性對(duì)照也容易從SKBR3上洗脫下來(lái)（圖4C）。

圖4 融合蛋白分別與SKBR3、MCF7的結(jié)合效率對(duì)比，GFP陰性對(duì)照與SKBR3結(jié)合效率對(duì)比

3 討論

有研究表明，將抗HER2單鏈抗體與其他基因融合構(gòu)建融合蛋白，將同時(shí)具有靶向性和殺傷性，對(duì)抗HER2單鏈抗體的高級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響。Wang等[8]將抗HER2單鏈抗體與毒素蛋白ETA融合構(gòu)建融合蛋白ScFv（FRP5）-ETA，研究其在前列腺癌LNCaP中的作用，結(jié)果ScFv（FRP5）-ETA融合蛋白可靶向性結(jié)合HER2過(guò)表達(dá)的前列腺癌LNCaP細(xì)胞表面從而將效應(yīng)分子毒素蛋白ETA靶向性輸入癌細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的固縮、核濃縮等形態(tài)特征。Zhao等[9]將抗HER2單鏈抗體與前凋亡因子顆粒蛋白酶B融合構(gòu)建融合蛋白，利用抗HER2單鏈抗體靶向性結(jié)合Jurkat細(xì)胞研究凋亡因子作用，結(jié)果該融合蛋白可特異性促使Jurkat凋亡。此外，以抗HER2單鏈抗體作為導(dǎo)向系統(tǒng)偶聯(lián)各種HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的HER2受體并特異性殺死該腫瘤細(xì)胞的研究[10-13]還有很多。這些研究在結(jié)果驗(yàn)證中，均采用間接免疫熒光染色法觀(guān)察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)，而融合基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況則采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

本研究將抗HER2-ScFv基因片段置于融合基因的上游，綠色熒光蛋白GFP置于融合基因的下游，利用綠色熒光蛋白的報(bào)告作用分析抗HER2 ScFv-GFP單鏈抗體的靶向性。通過(guò)將融合基因進(jìn)行序列測(cè)定并進(jìn)行Blast比對(duì)表明，該融合基因中抗HER2單鏈抗體（813 bp）片段沒(méi)有任何突變，其與下游的GFP（720 bp）之間僅僅多了一個(gè)BamHI位點(diǎn)6 bp左右，全基因序列長(zhǎng)度為1539 bp。從理論上分析，將多出兩個(gè)氨基酸，該融合基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中正確表達(dá)的蛋白相對(duì)分子量應(yīng)為58 kDa。將該融合基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pBAD His B上后，從該原核表達(dá)載體結(jié)構(gòu)序列圖譜分析，pBAD His B核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）后的第一個(gè)翻譯起始密碼子與目的融合基因的起始密碼子ATG之間多出ATG、6×His、Xpress epitope、Enterokinase site等結(jié)構(gòu)，約多翻譯出40個(gè)氨基酸，故原核表達(dá)成功后該融合抗體理論蛋白質(zhì)相對(duì)分子量應(yīng)為60 kDa左右。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)均表明融合蛋白成功在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。

在驗(yàn)證其靶向結(jié)合乳腺癌HER2陽(yáng)性細(xì)胞的研究中，我們將抗HER2 ScFv-GFP在原核表達(dá)系統(tǒng)pBAD His B/anti-HER2-ScFv-GFP/TOP10中表達(dá)，利用Ni2+-NTA層析法純化融合蛋白產(chǎn)物，研究其與腫瘤細(xì)胞的靶向結(jié)合效率。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡直接觀(guān)察綠色熒光的分布情況，結(jié)果表明融合蛋白抗HER2-ScFv-GFP可與HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞SKBR3表面的HER2受體特異性結(jié)合，而與HER2陰性腫瘤細(xì)胞MCF7混合后，容易被1×PBS沖洗掉，則認(rèn)為HER2陰性腫瘤細(xì)胞MCF7表面因無(wú)HER2表達(dá)，故無(wú)法接受抗HER2的單鏈抗體，也無(wú)法觀(guān)察到綠色熒光。而GFP標(biāo)準(zhǔn)品與SKBR3的結(jié)合實(shí)驗(yàn)也排除了是GFP本身與HER2受體結(jié)合的可能性。因此，當(dāng)該融合蛋白在靶向結(jié)合HER2陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞時(shí)，僅需用激光共聚焦顯微鏡或者普通熒光顯微鏡觀(guān)察綠色熒光就可直接判斷靶向結(jié)合效率，而不需通過(guò)流式細(xì)胞儀和間接免疫熒光染色法。但是，從SKBR3細(xì)胞表面分布的綠色熒光看，細(xì)胞變化并不十分明顯，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，是否是因?yàn)樵吮磉_(dá)載體自身的缺陷性而導(dǎo)致該融合蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，還是其他原因，需要對(duì)該融合蛋白進(jìn)一步研究其高級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)判斷。

本實(shí)驗(yàn)的成功使原來(lái)不可見(jiàn)的單鏈抗體封閉乳腺癌細(xì)胞表面HER2受體現(xiàn)象在熒光蛋白的報(bào)告下能夠變得可見(jiàn)，可更直觀(guān)分析乳腺癌細(xì)胞凋亡與單鏈抗體濃度變化的關(guān)系。同時(shí)，利用攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體的靶向性開(kāi)發(fā)分子診斷試劑盒在腫瘤分型、初期診斷等方面具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

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