吳聰華，程 華，李琳玲，姜德志，袁紅慧，程水源*

(1.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2.黃岡師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃岡 438000；3.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

黃酮類化合物(flavonoids)是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)的化合物.它們分子中有一個(gè)酮式羰基，第一位上的氧原子具堿性，能與強(qiáng)酸成鹽，其羥基衍生物多具黃色，故又稱黃堿素或黃酮[1].黃酮(flavonoids)主要是由C6-C3-C6組成(圖1).依據(jù)C3部分的形成方式(氧化、成環(huán)、取代)的差異，可將黃酮分為黃酮醇、查爾酮、橙酮、黃酮類、異黃酮、花青素以及各類二氫衍生物[2-3].

圖1 黃酮類化合物的基本骨架

對(duì)于人類來說黃酮類化合物不僅賦予了植物美好的顏色和口感，而且這些化合物本身對(duì)人類健康具有多種保健和醫(yī)藥功能[4].它們可以清除自由基，抗氧化，消炎，抗病毒，抗癌，發(fā)揮植物雌激素活性，保護(hù)心血管系統(tǒng)和肝臟，抑制酒精嗜好癥，防止骨質(zhì)疏松等.隨著分離純化技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物種類越來越多.為了找到更多、藥效更好的黃酮單體并研究其藥理作用，對(duì)藥用植物中黃酮的分離提純方法[5]研究就顯得尤為重要.

1 藥用植物黃酮類化合物的提取工藝

1.1 植物黃酮類化合物簡介

黃酮類化合物是一種植物中分布廣而且重要的多酚類天然產(chǎn)物，廣泛存在于高等植物，也存在于許多低等植物如苔蘚和地錢中，即幾乎存在于所有的綠色植物中，尤以蕓香科、唇形科、石南科、玄參科、豆科、苦苣苔科、銀杏科和菊科等高等植物中分布較多[6].在中草藥和現(xiàn)代醫(yī)藥方面，黃酮類化合物有著重要的作用.銀杏、菊花、葛根、柚皮、馬鞭草、金銀花等一系列富含黃酮類化合物植物的研究不斷深入，科研工作者在黃酮的提取方面做了大量工作[7-13].

1.2 黃酮類化合物提取方法

1.2.1 水提取法 黃酮類化合物的水提取法(Water Extraction, WE)是一種較傳統(tǒng)的方法[14]，目前已較少使用.在不破壞黃酮化合物結(jié)構(gòu)的情況下，林啟訓(xùn)[15]對(duì)枇杷葉中黃酮類化合物進(jìn)行了相關(guān)提取摸索，并且摸索出了一套優(yōu)化提取條件.肖坤福[16]在對(duì)多穗柯中黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究中也對(duì)水提法作了較詳細(xì)的介紹，此法為日常生活中食用富含黃酮類化合物食物提供了較好的參考價(jià)值.

1.2.2 醇提取法 醇提取法(SE)較水提法效率要高.對(duì)于含黃酮植物，有機(jī)溶劑提取法是比較常用的一種方法.SE法提取有機(jī)溶劑主要有乙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙醚等，其中最常使用的溶劑是乙醇.劉銀芳[17]摸索出了一套優(yōu)化的乙醇提取條件，給沙苑子中黃酮類化合物的提取帶來了極大的便利.陳少峰[18]在提取柴胡中總黃酮時(shí)，選定的優(yōu)化條件為：溫度80 ℃、柴胡顆粒粒徑1 mm、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、攪拌速度300 r·min-1，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表觀活化能為33.271 kJ·mol-1.在醇提法中，甲醇也是一種常用的提取劑，較之乙醇其提取效果更好.在實(shí)驗(yàn)過程中，為了得到純度更佳的黃酮類化合物，通常還要進(jìn)行石油醚或己烷的脫脂或脫色素預(yù)處理，然后再用甲醇、乙醇、丙醇及它們的一系列水溶液溶劑來進(jìn)一步提取.

1.2.3 超聲波提取法 超聲波提取法(ultrasound-assisted extraction, UAE)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種方法，具有操作方便，實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn).卞杰松[19]在對(duì)馬鞭草中黃酮化合物的測(cè)定中，利用超聲波結(jié)合乙醇法得到的黃酮類化合物的總含量為8.36 mg/g，回收率為99.56%，效果良好.很多科研工作者將超聲波法和其它方法聯(lián)合在一起效果更佳.通過微波-超聲波法的協(xié)同作用，張培宇等[20]對(duì)馬齒莧中黃酮化合物的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化：在馬齒莧20倍量體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇的條件下，輔助微波功率600 W處理5 min，置80 ℃溫水浴中超聲提取2次，每次提取15 min；此時(shí)的提取產(chǎn)率為11.35%，而相同條件下超聲波法和微波法的提取產(chǎn)率分別為5.79%和4.56%.由此可見，微波-超聲波聯(lián)用比單獨(dú)提取效果更好.此外，在醇提法的基礎(chǔ)上還可以使用超聲波法做預(yù)處理，效果也較理想.例如，張公亮[11]采用超聲波萃取法，研究仙人掌黃酮類化合物的提取工藝.通過試驗(yàn)確定了超聲波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)及輻射時(shí)間的最佳參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、功率550 W、輻射時(shí)間12 s，并且AB-8型樹脂分離提純效果最好，吸附率為84.81%，解吸率達(dá)88.42%.

1.2.4 微波提取法 微波提取法(Microwave extraction, ME)同其它方法相比具有操作簡便，耗能耗材少等優(yōu)點(diǎn).尤其對(duì)特定的藥材提取效果更為理想.譚靜[21]等通過微波提取法和超聲波提取法提取柚皮中的黃酮類化合物進(jìn)行了對(duì)比，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：微波萃取法提取柚皮中黃酮類化合物的最佳條件為料液比1∶25(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、提取時(shí)間為20 min、提取溫度為50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃酮得率最高，為8.437 mg/g；超聲波提取法提取柚皮黃酮的最佳條件為：料液比1∶25(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、提取時(shí)間為10 min、提取溫度50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，此時(shí)黃酮得率為5.263 mg/g.微波法常用來作為一種輔助手段使植物黃酮提取效率最大化.

1.2.5 超臨界萃取技術(shù) 超臨界萃取技術(shù)(supercritical fluid extraction, SFE)是使用較為廣泛的藥物提取、分離手段，在藥物成分提取方面有著重要的應(yīng)用意義.王敏[22]通過試驗(yàn)對(duì)銀杏葉黃酮的超臨界萃取技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并且實(shí)現(xiàn)了萃取和分離一體化，其最佳參數(shù)為：CO2流速為20 L/h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，乙醇夾帶劑用量為100 mL/100 g銀杏葉，萃取時(shí)間為2 h，萃取溫度為45 ℃，萃取壓力為30 MPa.在對(duì)鎖陽黃酮化合物超臨界二氧化碳的提取研究中，Luan N[23]通過實(shí)驗(yàn)找到了最佳提取參數(shù)：在粒度為0.180～0.250 mm篩，壓力為30 MPa，溫度為50 ℃，時(shí)間為75 min，酒精體積分?jǐn)?shù)為50%，攜帶率為8%，通量二氧化碳為5 mL/min條件下，總黃酮的產(chǎn)率可達(dá)21.18%.

1.2.6 酶解法 酶解法(enzyme-assisted extraction, EAE)是通過酶的作用裂解植物細(xì)胞壁，使得植物次生代謝產(chǎn)物充分得到釋放，從而提高藥用成分得率一種分離提取方法.吳梅林[9]在研究銀杏黃酮類化合物酶解法的提取條件中獲得了黃酮類化合提取的最好條件，與傳統(tǒng)的乙醇提取工藝相比，銀杏總黃酮得率提高了18.92%.龐允[7]在研究銀杏葉中黃酮的提取工藝時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解法同乙醇提取法相比，黃酮的提取率由1.29%提高為1.78%.劉曉光[24]采用酶解法對(duì)山楂中黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，在酶質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，酶解pH值為5.0，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間為90 min，料液比為1∶12 (質(zhì)量比)時(shí)，提取效果最佳.該方法提取黃酮的得率可達(dá)90%，而且黃酮的生物活性保持良好.在酶解法中，酶種類的選擇對(duì)提取效率也有一定的影響.林宣賢[25]分別用單一酶和復(fù)合酶方法對(duì)金櫻子黃酮進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶(纖維素酶+果膠酶+β-葡聚糖酶+半纖維素酶+木瓜蛋白酶)處理效果比單一酶要好，最后提取總黃酮產(chǎn)率真提高了26.2%.

2 黃酮類化合物主要分析方法

2.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法(UV spectrophotometry)測(cè)定原理是：黃酮類化合物固有的結(jié)構(gòu)可以與Al3+結(jié)合形成絡(luò)合物，并且在不同條件下具有不同的紫外吸收峰，因此可以對(duì)不同的黃酮類化合物進(jìn)行分析測(cè)定.張公亮[26]和齊曼麗[27]在研究中發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物直接與AlCl3絡(luò)合時(shí)，在415 nm可以檢測(cè)到總黃酮最高吸光值.而與Al(NO3)3作用時(shí)，在271 nm處可以檢測(cè)到黃酮類化合物的最高吸收值，從而可以對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定[28].呂紅[29]在267 nm條件下直接測(cè)定銀杏制劑中的黃酮含量，效果也較好.研究[30]發(fā)現(xiàn)，并不是所有的黃酮類化合物都能與鋁鹽發(fā)生絡(luò)合.杜薇[31]在有醋酸鉀或醋酸鈉存在的條件下測(cè)定刺梨總黃酮含量，AlCl3與黃酮類化合物共存40 min后，可在420 nm處測(cè)定總黃酮的含量.張進(jìn)棠[32]采用此法測(cè)定銀杏中黃酮總含量時(shí)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%.同時(shí)，張?zhí)m杰[33]利用雙波長法測(cè)得黑玉米花粉中總黃酮平均含量為3.53%.此法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好.另外，肖福坤通過三波長分光光度法測(cè)定芹菜中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為[34]，回收率為96.8%～105.9%，變異系數(shù)小于0.49%，方法的準(zhǔn)確度與精密度均令人滿意，而且操作簡便易行.

圖2 AlCl3和AlCl3/HCl對(duì)黃酮紫外光譜的影響

2.2 傳統(tǒng)色譜柱純化

傳統(tǒng)色譜柱純化(Column purification)在分離純化黃酮類化合物方面有著重要的作用.程秀麗[35]在研究羅布麻葉中黃酮類化合物時(shí)，采用聚酰胺柱、硅膠柱和Sephadex LH-20柱層析法對(duì)黃酮進(jìn)行純化，通過化學(xué)、波譜方法分離得到了8種黃酮類物質(zhì)，并且鑒定出其中的5種化合物.徐小花[36]采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20、重結(jié)晶等方法，在女貞子(Ligustrum lucidum Ait)果實(shí)中分離得到了芹菜素(Ⅰ)、大波斯菊苷(Ⅱ)、芹菜素-7-O-乙酰-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷(Ⅳ)、木樨草素(Ⅴ)、木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)、槲皮素(Ⅶ)等7種黃酮類化合物.在對(duì)連錢草黃酮化合物成分的研究中，楊念云[37]采用工業(yè)酒精提取、硅膠柱層析、ODS柱層析和重結(jié)晶相結(jié)合的方法，首次從連錢草中分離得到了芹菜素(1)、木犀草素(2)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸乙酯苷(3)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸乙酯苷(4)、大波斯菊苷(5)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(6)、山奈酚-3-O-蕓香糖苷(7)、蘆丁(8)、6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖-芹菜素(9)和6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖-芹菜素(10)等10種黃酮類化合物.

2.3 薄層色譜法

薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC).梁淑芳[38]在研究山楂時(shí)，采用十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正庚烷-水微乳液作為展開劑，利用聚酰胺薄層色譜法將山楂黃酮完全分離，總共獲得了7個(gè)黃酮斑點(diǎn).衛(wèi)靜莉[39]采用薄層色譜法對(duì)樹脂純化后的無梗五加果總黃酮進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)薄層層析鑒定效果較好.鄭大成[13]利用薄層色譜法和化學(xué)定性分析法對(duì)昆侖雪菊水溶性黃酮進(jìn)行初步的色譜和化學(xué)鑒定，結(jié)果顯示水提物經(jīng)正丁醇萃取后，大部分黃酮類成分被轉(zhuǎn)移至正丁醇層，該方法成功應(yīng)用于昆侖雪菊水溶性總黃酮的制備.

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)最早由俄國植物化學(xué)家茨維特(Tswett)1906年提出，后經(jīng)過不斷改進(jìn)和創(chuàng)新現(xiàn)已得到廣泛應(yīng)用.在測(cè)定鳳尾茶中黃酮的含量時(shí)陳海云[40]運(yùn)用島津LC-2010A，色譜柱為Agilent-Extend-RP柱，流動(dòng)相甲醇-乙腈-0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))磷酸，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長280 nm，在0.244～2.928 μg線性關(guān)系良好，回收效率較高.而賀云彪[41]在采用高效液相色譜法測(cè)定黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量時(shí)，借直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影(HELP)法分辨HPLC-DAD產(chǎn)生的二維數(shù)據(jù)得到毛蕊異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=166.72x+127.8(r=0.999 7)線性范圍為1.0～116.5 μg/mL；孟雙明[42]運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)黃酮含量進(jìn)行分離測(cè)定，得到了蘆丁、曲克蘆丁、黃芩苷、槲皮素的RSD分別為1.7%，2.0%，3.1%和3.9%.張宏武[43]采用Sunfire C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 mm)，以乙腈-0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))磷酸溶液(體積比20∶80)為流動(dòng)相，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長為283 nm，柱溫為30 ℃時(shí)，測(cè)定枳殼飲片中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷四種黃酮類化合物的平均回收率分別為96.6%，96.1%，96.0%和97.2%，此法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好.

2.5 其它分析方法

除了以上分離純化方法外，還有其他一些方法應(yīng)用較為廣泛.張軍[44]采用高效毛細(xì)管電泳法對(duì)不同桑品種的桑葉中，進(jìn)行了黃酮類化合物的圖譜建立，在25 ℃、20 kV的壓力下進(jìn)行電泳，245 nm波長處檢測(cè)，線性關(guān)系良好.彭愛一[8]和余波[45]采用改進(jìn)的高速逆流色譜法分離純化幾種黃酮類化合物，其純化率分別達(dá)到了95%和97%以上.多種分離純化技術(shù)的聯(lián)用也使得分離測(cè)定效果更佳，謝建偉[10]運(yùn)用色譜和光譜聯(lián)用技術(shù)建立了4個(gè)產(chǎn)地黃芪中黃酮類化合物特征色譜指紋圖譜，張語遲[12]采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(HPLC-ESI MS)聯(lián)用技術(shù)分析了酶解前后黃酮化合物的活性，效果較為理想.

3 結(jié) 語

黃酮類化合物作為一大類植物次生代謝產(chǎn)物，不僅數(shù)量種類繁多，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，表現(xiàn)出多種多樣的藥理活性.科研工作者正在不斷的完善各種分離純化手段，為獲得更好更多的黃酮類化合物或黃酮單體進(jìn)行努力，鮑海鷗[46]等人對(duì)廬山的野生藥用植物資源給出了分析和建議，張馨心[47]和鄭有飛[48]就對(duì)黃酮的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了分析.對(duì)黃酮類化合物分離檢測(cè)純化方法的深入研究將對(duì)黃酮類化合物的開發(fā)應(yīng)用，藥理活性研究等產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響.

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