榮良燕, 姚 拓*, 趙桂琴, 柴 強, 席琳喬, 王小利

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,蘭州 730070; 2.草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,蘭州 730070; 4.塔里木大學(xué)動物科技學(xué)院,阿拉爾 843300;5.貴州省草業(yè)研究所,獨山 558200)

促進植物生長菌(plant growth promoting rhizobacteria,簡稱PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根、莖、葉的一類可促進植物生長及其對礦質(zhì)營養(yǎng)吸收和利用,并能抑制有害微生物的有益菌類[1]。鐵元素雖在地殼中含量較高,但由于地球的富氧環(huán)境,鐵的氧化物以溶解度極低的形式存在,不易直接被植物吸收利用。鐵載體(siderophores)是一類具有很強的特異螯合Fe3+(螯合系數(shù)可達1 020～1 030)的小分子(1～2 ku)化合物[2-3],許多植物根際微生物可通過合成這類物質(zhì)來攝取環(huán)境中的鐵,并將多余的鐵提供給植物利用,可以與植物根際鐵載體產(chǎn)量很小的有害病原菌競爭鐵元素,進而抑制有害微生物的生長和繁殖[4]。目前應(yīng)用最為普遍的細(xì)菌鐵載體檢測方法是Schwyn與Neilands于1987年建立的CAS檢測體系(chromeazurol sulfonate assay),適用于許多不同類型鐵載體的檢測[5],且CAS染液對G-細(xì)菌毒性較小,還能用于G-細(xì)菌鐵載體固體平板檢測[6]。本研究利用改進的CAS檢測方法[6]從16株P(guān)GPR菌株中選出具有鐵載體分泌能力的菌株,并與植物病原真菌進行拮抗作用測定,以期篩選出較強抗病的促生菌株,服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 LB培養(yǎng)基配方

1 L培養(yǎng)基中含：葡萄糖10 g,酵母膏5 g,NaCl 5～10 g,瓊脂 15～20 g,pH7.0。

1.1.2 SA液體培養(yǎng)基配方

1 L培養(yǎng)基中含：蔗糖 20.0 g、L-天門冬酰胺2.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4?7H2O 0.5 g;8-羥基喹啉除鐵后,無外加鐵離子,其本底鐵離子濃度約為 0.16 μ mol/L,pH7.0[7]。

1.1.3 CAS檢測平板配方

CAS染液配制：1 mmol/L CAS(鉻天青),0.1 mmol/L FeCl3,4 mmol/L十六烷基三甲基溴化胺(HDTMA)[5,8],0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH6.8[6]。

0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液pH6.8的配制：每100 mL含Na2HPO4?12H2O 2.427 g,NaH2PO4?2H2O 0.590 5 g,KH2PO40.075 g,NH4Cl 0.250 g,NaCl 0.125 g,使用時10倍稀釋[6]。

CAS檢測平板的配制：每100 mL含20%蔗糖溶液1 mL,10%酸水解酪素3 mL,1 mmol/L CaCl2100 μ L,1 mmol/L MgSO42 mL,瓊脂 1.8 g[6]。

在約60℃時緩慢加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液和CAS染液各5 mL,混合均勻即得藍色檢測平板[6]。所有溶液均用去離子水配制,具體用量視所需制備平板個數(shù)及所需藥品含量換算后添加,可以將用量少的溶液先制成母液而后在使用時定容至所需濃度。定性定量試驗中所用玻璃器皿均用6 mol/L的HCl浸泡并用蒸餾水沖洗數(shù)遍進行脫鐵處理。

1.1.4 PDA固體培養(yǎng)基配方

1 L培養(yǎng)基中含：馬鈴薯200 g,葡萄糖15～20 g,瓊脂17～20 g。

1.1.5 PGPR菌株

從蘭州三葉草、苜蓿和燕麥根際篩選出具溶磷、固氮和分泌植物生長激素特性的細(xì)菌。編號為191,92,170,LS1-1,LS1-2,LS3,LS13,LHS4-1,LHS4-2,LHS8,LHS9,LHS11,LHS14,LH11,LH13-3,LM4-3,由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物多樣性實驗室提供。

1.1.6 病原真菌

立枯絲核菌(Rhizoctonia solani),黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum),西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum),由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植病系徐秉良教授、陳秀蓉教授提供。

1.2 方法

1.2.1 鐵載體定性檢測方法

將保存在LB斜面上的PGPR菌株轉(zhuǎn)接到LB平板上培養(yǎng)24～48 h后,采用點接種法,用滅菌的牙簽將菌種接在CAS固體檢測平板上,一皿4個點,一個菌3個重復(fù),28℃培養(yǎng)48 h,并在培養(yǎng)箱中放盛有水的燒杯2個以保持一定的濕度。經(jīng)過培養(yǎng)的CAS檢測平板上,分泌鐵載體的細(xì)菌菌落周圍會出現(xiàn)明顯的橙色鐵載體暈圈。經(jīng)觀察后每個平板上菌落形態(tài)有差別,暈圈大小和顏色深淺不同,觀察平板上橙黃色透明圈的產(chǎn)生和大小、顏色,并記錄。同時,通過計算暈圈比例,即可溶性指數(shù)[9],來對其分泌鐵載體能力進行比較分析,以判斷產(chǎn)鐵載體能力強的菌株。

圖1 可溶性指數(shù)的計算方法

1.2.2 定量檢測方法

用鉑金絲接種新鮮菌種于限鐵SA液體(0.16 μ mol/L FeCl3)培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)(150 r/min)48 h;菌懸液經(jīng)10 000 r/min離心15 min,取上清液,菌液和CAS檢測液1∶1的體積充分混勻,靜止1 h后,測定630 nm[10]波長處的吸光值(As),取雙蒸水作為對照調(diào)零,以同法測定的未接種的SA液體培養(yǎng)基的吸光值作為參比值(Ar),并按Machuca和Miliagres的方法[11]計算鐵載體活性單位([(Ar-As)/Ar]×100)。

1.2.3 產(chǎn)鐵載體菌與病原真菌拮抗作用測定

將定性和定量檢測篩選出的優(yōu)良菌株,采用平板對峙法測定其與病原真菌的拮抗作用。將保存在PDA斜面上的病原真菌接種到PDA平板上,25℃培養(yǎng)5～7 d。細(xì)菌接種在LB液體培養(yǎng)基中,150 r/min,培養(yǎng)48 h,細(xì)菌菌液濃度 106μ g/mL備用。再將真菌與細(xì)菌同時接種在PDA平板上,平板中心接種真菌,菌餅直徑為6 mm;距中心1.7～1.8 cm處接種細(xì)菌,采用滴下法(即用加液槍,將菌液垂直滴加在培養(yǎng)基平面上),每種組合3個重復(fù)。25℃培養(yǎng)6 d,測量真菌距細(xì)菌遠端和近端的半徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)鐵載體PGPR菌初選

固體CAS培養(yǎng)基呈現(xiàn)天藍色的固態(tài)膠狀,通過點接種培養(yǎng)得到菌落,當(dāng)細(xì)菌分泌鐵載體時會在菌落周圍形成黃色暈圈(圖2),與藍色形成對比,其產(chǎn)生黃色暈圈越大,說明該菌株產(chǎn)鐵載體能力越強。本研究的16株P(guān)GPR菌株在CAS檢測平板上菌落大小及產(chǎn)鐵載體情況見表1。

圖2 PGPR菌產(chǎn)鐵載體的初選(圖為菌株LHS11)

表1 CAS檢測平板上菌落大小、暈圈直徑及其他特征1)

從表1可看出,16株被測菌株中有9株在CAS檢測平板上可以生長并產(chǎn)生橘黃色暈圈,暈圈從大到小分別為 LS1-2、LS13、LHS9、92、LHS11、191、LH12-3、170 和 LS1-1。暈圈顏色深淺不一,橘黃圈周圍的藍色也深淺不同。同時計算可溶性指數(shù),值越大,其分泌的鐵載體在培養(yǎng)基中的分布范圍越大,即其在相同培養(yǎng)條件和時間下產(chǎn)生鐵載體能力越強。本研究供試菌株中可溶性指數(shù)＞2,從大到小依次為92,LHS11,191,LH12-3,LS1-2和170(表1)。

2.2 產(chǎn)鐵載體PGPR菌復(fù)選

由于定性測定是根據(jù)暈圈直徑、可溶性指數(shù)和暈圈顏色等指標(biāo)進行的,該方法存在一定的局限性,如有的菌株的菌落較小但是其產(chǎn)生的變色暈圈的范圍大,具有在相對較短的時間內(nèi)產(chǎn)生較多鐵載體的能力,如：92、LHS11。有的菌落大小與一般產(chǎn)鐵載體細(xì)菌菌落無明顯差異但是其分泌能力稍強于該樣中其他各菌,如 191、LH12-3、LS1-2、170。因此 ,為了較為準(zhǔn)確測定其產(chǎn)鐵載體的能力,對可溶性指數(shù)＞2的菌株進行了定量復(fù)選,其結(jié)果見表2。

表2 各離心菌樣在630 nm波長處的吸光值及鐵載體活性單位

細(xì)菌分泌的鐵載體用CAS檢測液檢測時,在630 nm處的光吸收值最大,因此測定 A630 nm值的大小可以很好地反映溶液中鐵載體的含量,A630nm值越大則鐵載體含量越高,反之亦然。根據(jù)所測數(shù)據(jù)的大小可判斷出各個菌分泌鐵載體能力的大小,其順序為 LS1-2＞LHS11＞LH12-3＞92＞191＞170(表2)。但是CAS檢測液的吸收值在不同pH條件下極易產(chǎn)生偏差[12],而細(xì)菌培養(yǎng)液樣品pH變化較大,所以使得所測數(shù)據(jù)偏差較大。該種檢測方法對鐵載體的定量可以通過 A/Ar值的降低來衡量。A/Ar代表樣品中鐵載體的相對含量,該值越低,表明鐵載體含量越高,從小到大依次為 LS1-2＞LHS11＞LH12-3＞92＞191＞170(表2)。

2.3 產(chǎn)鐵載體菌與病原真菌拮抗作用測定

將5株經(jīng)過定性、定量檢測產(chǎn)鐵載體量較高的PGPR菌株與3株供試病原真菌分別進行拮抗作用測定,第3、6天測量真菌距細(xì)菌遠端和近端的半徑,細(xì)菌對病原真菌的抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%,抑菌率越高,細(xì)菌對真菌的抑制作用越高。進一步計算PGPR菌對3種病原菌的抑菌率,結(jié)果見圖3、表3。

圖3 PGPR菌與真菌拮抗

表3 PGPR菌與真菌拮抗及抑菌率

從表3可以看出,供試PGPR菌株191對立枯絲核菌和黃瓜枯萎病菌、LHS11對立枯絲核菌、黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌均有較好的抑制作用。在3 d時,LHS11對黃瓜枯萎病菌的抑制作用最好,抑菌率為53%,191對棉花立枯絲核菌、黃瓜枯萎病菌,LHS11對棉花立枯絲核菌的抑制作用相差不多,在41%～44%之間。5種組合中,除菌株191和LHS11外,其他3株P(guān)GPR對病原菌幾乎沒有抑制作用。在6 d時,LHS11對黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制作用最好,達到了 80%以上,其中LHS11對黃瓜枯萎病菌的抑菌率最高,達到84%。其次是191對黃瓜枯萎病菌,抑菌率為74%,191和LHS11對立枯絲核菌的抑制作用相差不多,抑菌率為64%～65%。LHS11對黃瓜枯萎病菌的抑制效果在3 d和6 d時都最好,LHS11對西瓜枯萎病菌的抑制效果在3 d較低,但到6 d時效果加強,191和LHS11對立枯絲核菌的抑制作用在3 d時較好,隨時間推后作用降低。其余PGPR菌落的邊緣與真菌菌絲接觸或真菌菌絲覆蓋了其菌落,說明這3株P(guān)GPR菌對提供的3株病原真菌無拮抗作用。

3 結(jié)論

3.1 鐵載體分泌能力

16株被測菌株中有9株在CAS檢測平板上可以生長并產(chǎn)生橘黃色暈圈,為 LS1-2、LS13、LHS9、92、LHS11、191、LH12-3 、170 和 LS1-1,初步確定這些PGPR菌株可以產(chǎn)生鐵載體。結(jié)合可溶性指數(shù)及定量檢測中630 nm波長處的吸光值和鐵載體活性單位,測定及計算出產(chǎn)鐵載體的能力從大到小的菌株依次為 LS1-2 、LHS11、LH12-3、92、191。

3.2 產(chǎn)鐵載體菌對病原真菌拮抗作用

在平板對峙拮抗試驗中菌株191和LHS11對供試的病原真菌均有較好的抑制作用,其中LHS11對黃瓜枯萎病菌,西瓜枯萎病菌的抑制作用最好,LHS11對黃瓜枯萎病菌的抑菌率達到了84%。其次是191對黃瓜枯萎病菌的拮抗作用,抑菌率為74%。191和LHS11對棉花立枯絲核菌的抑制作用相近,抑菌率在64%～65%之間。

4 討論

試驗中選用了指示性較強的CAS培養(yǎng)基作為產(chǎn)鐵載體鑒定、菌篩的首選,當(dāng)高鐵螯合能力的鐵載體從有絡(luò)天青、鐵離子和十六氨基烷基溴化銨形成的CAS藍色檢測液中奪取了鐵離子時,檢測液即會發(fā)生明顯的由藍到橙的顏色改變,但是絡(luò)天青在不同pH條件下會顯示出不同的顏色,所以配置的固體培養(yǎng)基選用了改進后的CAS固體檢測培養(yǎng)基,即采用了pH 6.8的磷酸緩沖液代替了原來的MM9緩沖體系[6],1994年王平[13]采用通用的CAS檢測方法檢測到了小麥根圈細(xì)菌的鐵載體分泌。作者運用類似的方法進行了產(chǎn)鐵載體菌的篩選,并對其中效果好的菌株與植物病原真菌進行拮抗試驗,篩選出2株對3種植物病原真菌有抑制作用的生防菌。

某些熒光假單胞桿菌及其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)可抑制一些植物病原真菌,國內(nèi)外研究證實假單胞菌產(chǎn)生的鐵載體在防治土傳真菌病害方面發(fā)揮著重要作用[14]。本試驗從已篩選出的具溶磷、固氮及分泌植物生長激素能力的細(xì)菌中繼續(xù)進行產(chǎn)鐵載體能力的篩選。在定性、定量試驗中篩選出5株,將其分別與病原真菌進行拮抗試驗。在定量試驗中菌株 LS1-2的效果最好,菌株191的效果列最后,但在與病原真菌拮抗試驗中LS1-2的優(yōu)勢卻沒有顯示出來,LHS11和191成為對病原真菌抑制作用最好的菌株。實際上,細(xì)菌對病原真菌的拮抗作用是由其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)來決定的,鐵載體只是其中可能的一類拮抗物質(zhì)。從本研究的結(jié)果來看,菌株 LS1-2、LH12-3、92均產(chǎn)生鐵載體,但是其無抗病原菌的活性,可以初步得出菌株LS1-2產(chǎn)生鐵載體與其抗菌活性沒有必然關(guān)系。這一研究結(jié)果與Laine等人測定了CAS法對細(xì)菌產(chǎn)鐵載體量和拮抗病原菌能力的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)兩者之間并不是正相關(guān),有的細(xì)菌產(chǎn)鐵載體量雖然較多,但并非在實際中可以很好地抑制某種病原真菌[15]的結(jié)果相似。因此,本研究中對病原真菌抑制作用最好的菌株(如LHS11和191)其抑菌機理跟產(chǎn)生鐵載體是存在必然聯(lián)系,還是偶然巧合,抑或另有其他抗菌物質(zhì)產(chǎn)生尚需做進一步的研究來證實,相關(guān)研究正在進行中。

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