劉 清，彭曉英*，劉永濤，周雙德，趙黎明，張良波

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128; 2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南長沙 410004)

光皮樹 (Swida wilsoniana Wanaer)為山茱萸科(Cornaceae)梾木屬 (Swide opiz)落葉灌木或喬木，其干果含油率達26%～36%，且果實油中含油酸和亞油酸高達77.68%，可通過酯化工藝制取生物柴油［1－2］。其燃料特性和動力性與0#柴油相似，是一種優(yōu)良的代用燃料［3－5］。對石油能源枯竭的擔(dān)憂，以及利用光皮樹油制取生物柴油研究的快速開展，使得光皮樹作為重要的生物柴油原料得到廣泛關(guān)注。

目前，光皮樹的繁殖主要是通過播種育苗、扦插育苗和嫁接繁殖［6－8］，播種育苗子代個體分化明顯，難以保持母本的優(yōu)良性狀;而扦插和嫁接育苗周期較長，易受病蟲害影響。如能運用組織培養(yǎng)技術(shù)建立光皮樹無性系，則可以不受氣候影響，在較短時間內(nèi)繁育大量光皮樹良種苗木［7］。因此，本研究擬采用組織培養(yǎng)手段，通過愈傷組織的誘導(dǎo)和分化及腋芽增殖等途徑，旨在建立光皮樹離體繁殖體系。

1 材料與方法

1.1 材料

采自湖南省林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟林苗圃的光皮樹成熟種子 (2007年11月成熟)和嫩枝條 (2008年3月采集)。

1.2 方法

1.2.1 光皮樹種子和嫩枝條處理

(1)光皮樹種子處理:將光皮樹種子摩擦破皮，消毒后接種于基本培養(yǎng)基中。15 d左右種子開始萌動，長出子葉和胚軸。分別以子葉和胚軸為外植體進行培養(yǎng)。

(2)光皮樹嫩枝條處理:將采集的嫩枝條放在裝有少許自來水的燒杯中，培育一周左右。待光皮樹腋芽伸長后，分別以莖段、頂芽、葉片和帶腋芽的莖段為外植體進行培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度25±2℃，日光燈光照14 h/d，光照強度為2 000 lx。

1.2.3 取材與接種 將光皮樹種子接種到基本培養(yǎng)基上，獲得無菌種子苗。①切割其胚軸和子葉分別以平放和豎插兩種方式轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。②切割莖段、頂芽、葉片和帶腋芽莖段為外植體，莖段和頂芽切段、葉片切塊，用70%酒精快速浸泡，無菌水沖洗后轉(zhuǎn)入0.1%的升汞中消毒，無菌水沖洗3次。70%酒精的浸泡時間取0、30、60 s，0.1%升汞溶液的消毒時間取4、6、9 min。然后接種于基本培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。10 d后統(tǒng)計污染率，20 d后統(tǒng)計褐化率。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo) 將切割的莖段、頂芽、葉片、胚軸、子葉和帶腋芽的莖段分別接種于附加不同濃度配比的2，4—D和KT的MS培養(yǎng)基中，在愈傷組織誘導(dǎo)試驗過程中，2，4—D設(shè)3個濃度梯度，KT設(shè)3個濃度梯度。出愈率為培養(yǎng)30 d后誘導(dǎo)出愈傷的外植體數(shù)與接種外植體數(shù)之比。

1.2.5 不定芽的誘導(dǎo) 將誘導(dǎo)出的愈傷組織切塊，接種于附加不同濃度配比的6—BA和NAA的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察愈傷組織的生長情況。愈傷組織的誘導(dǎo)分化試驗設(shè)計中6—BA設(shè)5個濃度梯度，NAA設(shè)2個濃度梯度。分化率為培養(yǎng)30 d后分化的愈傷組織數(shù)與接種愈傷組織數(shù)之比。

1.2.6 腋芽增殖 將經(jīng)過處理的腋芽接種于添加不同濃度配比的6—BA和KT的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，觀察腋芽增殖過程中所發(fā)生的變化。其中帶腋芽的莖段分為平放和豎插兩種方式。在試驗過程中，6—BA設(shè)5個濃度梯度，KT設(shè)2個濃度梯度。增殖率為培養(yǎng)30d后總的腋芽數(shù)目與最初接種時的腋芽數(shù)目的比值。

1.2.7 根的誘導(dǎo) 待叢芽長至2～3 cm時，切割分離，轉(zhuǎn)入不同濃度配比的IAA和NAA的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根。NAA和IAA均設(shè)3個濃度梯度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對不同外植體的影響

用70%酒精和0.1%升汞溶液對光皮樹的莖段、頂芽、葉片分別進行消毒處理，不同處理時間的效果見表1。

表1 不同消毒試劑和消毒時間對外植體的影響Tab.1 Effects of different sterilization reagent and sterilization time on explants

表1結(jié)果顯示:單獨使用升汞消毒時，各外植體的污染率最高，如莖段污染率達到15%，而與酒精配合使用后，污染率有明顯下降，當(dāng)酒精中浸泡時間為30 s時，莖段污染率下降至10%。這是因為光皮樹莖段、頂芽和葉片表面都有細柔毛，而70%的酒精穿透力較強，能短時間滲透消毒，故與升汞搭配使用較為適宜。隨酒精和升汞溶液中消毒時間的延長，外植體的污染率呈下降趨勢，而褐化漸趨明顯，褐化率上升。從表1中結(jié)果看出，莖段作為外植體時，在酒精中浸泡30 s后清洗，再于升汞溶液中消毒4～6 min時，材料的污染率較小，且褐化率相對較低，最佳的消毒時間為70%酒精30 s，0.1%升汞9 min;頂芽最佳的消毒時間為70%酒精30 s，0.1%升汞4 min;而葉片表面柔毛較多，故70%酒精60 s后0.1%升汞中處理4 min，能達到較理想的效果。

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

光皮樹愈傷組織誘導(dǎo)頻率與外植體來源有直接關(guān)系。六種外植體在接種到不同生長調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基中，均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)條件和愈傷組織的生長情況不盡相同。(見表2)葉片在第8天開始卷曲，切口邊緣開始長出亮白色的愈傷組織 (圖1a);莖段在第4天開始啟動 (圖1b)，10 d后長出淡黃色致密愈傷組織，生長迅速 (圖1c);頂芽啟動稍晚些，但生長較快，后期長勢良好 (圖1g)。

結(jié)果表明:2，4—D濃度在1～4 mg/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率呈上升趨勢，但2，4—D濃度過高 (4 mg/L)抑制愈傷組織的產(chǎn)生，導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。當(dāng)2，4—D和KT濃度分別為2 mg/L和0.5 mg/L時，愈傷組織的誘導(dǎo)率較高。其中莖段在最適培養(yǎng)基上出愈率最高，達到90%，愈傷組織質(zhì)地致密顏色淡黃綠色，生長速度較快 (圖1c);葉片的出愈率次之，后期達到89%，愈傷組織質(zhì)地疏松顏色發(fā)白 (圖1a);子葉的出愈率達到88%，形成了質(zhì)地疏松，淡黃色愈傷組織，后期呈現(xiàn)玫瑰紅色(圖1d);帶腋芽的莖段出愈率達到84%，形成了疏松，玻璃化的愈傷組織 (圖1e);胚軸的出愈率達到81%，形成了疏松玻璃化的愈傷組織 (圖1f);頂芽的出愈率也達到85%，形成了致密，淡黃色的愈傷組織(圖1g)。

表2 不同濃度組合植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different plant growth substances combination on callus induction

圖1 光皮樹不同外植體的愈傷組織 (一)Fig.1 The callus of different explant of S．wilsoniana(a)

2.3 不同生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對愈傷組織分化的影響

將切塊的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基 (MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L和MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L)中進行培養(yǎng)，20 d后發(fā)現(xiàn)由葉片、胚軸、子葉和帶腋芽的莖段長出的愈傷組織均呈現(xiàn)玻璃化和黏液化現(xiàn)象。而由莖段長出的愈傷組織質(zhì)地依然致密，顏色淡黃綠色。因此，將由莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比的培養(yǎng)基上，35 d后統(tǒng)計愈傷組織上的不定芽分化率并記錄愈傷組織的變化情況。結(jié)果見表3。

實驗結(jié)果表明:由莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于上述供試培養(yǎng)基中均未分化。隨著6—BA濃度的升高，愈傷組織的質(zhì)地由疏松變化成稍致密，顏色由透明變?yōu)闇\黃色再到淺黃綠色，為分化提供了可能性。6—BA(4.0 mg/L)和NAA(0.5 mg/L)稍有利于致密淺黃綠色愈傷組織的繼代培養(yǎng)。

表3 不同生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對不定芽分化的影響Tab.3 The concentration of different growth regulator combinations on the differentiation of adventitious buds

2.4 不同生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對光皮樹腋芽增殖的影響

將光皮樹帶腋芽的莖段接種于不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比的培養(yǎng)基中，接種方式分為平放和豎插。觀察腋芽增殖的情況，并記錄。結(jié)果見表4。

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對腋芽增殖的影響Tab.4 Different growth regulators and their concentration ratio on the impact of axillary bud proliferation

表4結(jié)果表明:帶腋芽的莖段在進行平放和豎插時，二者的增殖系數(shù)相差無幾。6—BA的濃度處于1.0 mg/L和8.0 mg/L時，腋芽的增殖系數(shù)較低。從總體上來看，隨著6—BA濃度的增大，增殖系數(shù)先增后降。6—BA濃度為4.0 mg/L、KT為0.5 mg/L時，兩種接種方式的增殖系數(shù)均最高，平放時可達3.4。帶腋芽的莖段平放時，接種4 d后腋芽開始萌動，呈淺嫩綠色且莖段基部膨大，10 d后在腋芽基部周圍產(chǎn)生數(shù)量不等的叢芽數(shù) (2～6個)(圖2a);豎插時，接種6 d后腋芽開始萌動，15 d后產(chǎn)生數(shù)量不等的叢芽數(shù) (1～5個)。其中平放時莖段腋芽增殖效果較好，生長明顯，長勢旺盛，莖段健壯 (圖2c)。

圖2 光皮樹不同外植體的愈傷組織 (二)Fig.2 The callus of different explant of S．wilsoniana(b)

2.5 不同生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對生根的影響

將叢芽轉(zhuǎn)接入供試生根培養(yǎng)基中，叢芽基部逐漸褐化或未見根的分化。其原因可能是因為光皮樹為多年生木本植物，而多年生木本植物普遍存在生根較困難或生根時間較長等現(xiàn)象［9］。另外供試生長調(diào)節(jié)劑的濃度組合可能不適宜光皮樹的生根培養(yǎng)。

3 討論

3.1 子葉和胚軸接種方式對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在本試驗中發(fā)現(xiàn)，子葉和胚軸誘導(dǎo)愈傷過程中，子葉和胚軸平放對誘導(dǎo)愈傷較好，這可能是因為子葉和胚軸平放，能充分接觸培養(yǎng)基，從中吸收養(yǎng)分，接受生長調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)，因此兩端切口處的出愈率高，愈傷組織長勢較好;當(dāng)子葉和胚軸插入培養(yǎng)基，僅切面細胞接觸，吸收及接受生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的面積小，向上運輸養(yǎng)分和生長調(diào)節(jié)劑困難，導(dǎo)致子葉和胚軸出愈率下降。在子葉和胚軸誘導(dǎo)不定芽再生過程中，僅僅產(chǎn)生愈傷，均未誘導(dǎo)出芽點，可能是細胞分裂素和生長素的比值影響了芽的分化，需要進一步探索誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基。

3.2 外植體類型與愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)系

來源于光皮樹不同部位的愈傷組織在結(jié)構(gòu)和顏色及生長特性等方面都有明顯的差異。本試驗以葉片、莖段、頂芽、子葉、胚軸和帶腋芽的莖段為外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)，該愈傷組織質(zhì)地疏松，在添加較高濃度的6—BA與適量NAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以莖段為外植體時，能在切口處膨大產(chǎn)生質(zhì)地稍硬的致密愈傷組織，顏色變成淺黃綠色。在同樣的培養(yǎng)條件下，葉片、頂芽、子葉和胚軸等外植體卻只能誘導(dǎo)出愈傷組織，顏色一般為透明，質(zhì)地疏松。分析其原因，可能是不同部位外植體的組織結(jié)構(gòu)和細胞類型不同，它們產(chǎn)生愈傷組織所需要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和所需量也有很大的差別。故以莖段為外植體，愈傷組織的啟動能力明顯比其他外植體強，誘導(dǎo)時間短于其他外植體的誘導(dǎo)時間，且愈傷組織生長速率快，細胞分裂時間短，這與有關(guān)報道所述光皮樹植株幼嫩莖段細胞分裂旺盛，易于再分化［10］相符。

3.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對外植體愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響

植物組織培養(yǎng)的愈傷組織分化過程是生長素含量逐步降低、細胞分裂素含量逐步升高的過程。本實驗中愈傷組織未能分化，一種可能是由于還不了解光皮樹自身激素的狀況，沒有找到適合誘導(dǎo)分化的細胞分裂素與生長素比值;另外一種可能是由于高質(zhì)量濃度的2，4—D對外植體及愈傷組織的傷害。一些研究者認(rèn)為，盡管較高質(zhì)量濃度的2，4－D有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，但高質(zhì)量濃度的2，4—D使整個培養(yǎng)系統(tǒng)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)比例始終處于高比例的生長素類似物狀態(tài)，從而不利于隨后進行的愈傷組織分化再生芽的過程［11－12］;第三種可能是由于所誘導(dǎo)的愈傷組織屬于非胚性愈傷組織，這與有關(guān)資料所述的“非胚性愈傷組織分化率低，甚至不分化”的觀點相符合［12－13］。

4 結(jié)語

本文分別從光皮樹愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、分化和腋芽增殖等途徑進行研究，各外植體均能誘導(dǎo)愈傷組織，但不定芽分化困難，在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的途徑中，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上相當(dāng)長一段時間內(nèi)形態(tài)上幾乎沒有變化。有研究者認(rèn)為初代培育時培養(yǎng)基配方中的酸性物質(zhì)使外植體處于酸性環(huán)境中并導(dǎo)致植物正常細胞首先發(fā)生細胞壁酸性降解，隨后出現(xiàn)原生質(zhì)體脫離細胞壁，進一步發(fā)生細胞器重組或細胞重建［14］。在愈傷組織形成后，如果轉(zhuǎn)移過早，還未形成成熟的脫分化組織;過晚，愈傷組織可能褐化或喪失進一步分化的能力。所以探索出合適愈傷組織的轉(zhuǎn)移及其分化時刻也是間接誘導(dǎo)不定芽途徑中非常重要的工作環(huán)節(jié)。今后還應(yīng)在繼代培養(yǎng)、不同時期的愈傷組織細胞切片以及次生代謝物方面作深入的研究，從而在生理的基礎(chǔ)上，了解其生長發(fā)育的機制。特別是如能從分子水平上檢測光皮樹不同發(fā)育階段對各種理化因子的需求，以及通過探索光皮樹不同生長期對各種生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答機制，了解不同生長調(diào)節(jié)劑之間和光皮樹的相互作用，從而建立一套完整的離體培養(yǎng)體系。這將對實現(xiàn)光皮樹工廠化育苗及進一步利用基因工程技術(shù)實現(xiàn)對高油含量光皮樹遺傳轉(zhuǎn)化奠定技術(shù)基礎(chǔ)，具有重要實踐意義。

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