亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        中藥對腎小球硬化大鼠MMP-9、TIMP-1及TGF-β1mRNA表達的影響

        2011-06-11 01:26:34倪晨王貴均王倩賴小平
        環(huán)球中醫(yī)藥 2011年3期
        關(guān)鍵詞:福辛普利鈉孵育

        倪晨 王貴均 王倩 賴小平

        腎小球硬化(glomerulosclerosis,GS)是腎小球疾病發(fā)展至終末期,腎功能衰竭的主要病理改變。其中細胞外基質(zhì)(ECM)降解減少、過度積聚,是GS的重要發(fā)病機制[1,2]。在ECM降解調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶MMP和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物TIMP[3](MMPs-TIMPs)系統(tǒng),隨著TIMP-1表達增強,MMP-9降解作用減弱,MMP-9/TIMP-1的比值失調(diào),最終形成腎小球硬化。此外,細胞因子在GS的形成過程中也起著非常關(guān)鍵的作用,其中轉(zhuǎn)化生長因子[4]TGF-β1的調(diào)控作用尤為重要。TGF-β1既能促進ECM合成增加,又能抑制ECM的降解,最終導致ECM聚積,形成腎小球硬化。本研究基于腎絡(luò)癥積理論,采用祛瘀化痰、散結(jié)消癥的治療方法,配伍川芎、鱉甲、海藻[6-8],考察祛瘀化痰、散結(jié)消癥中藥復方對腎小球硬化大鼠腎功能的作用。

        1 材料與方法

        1.1 儀器

        超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國harris公司),倒置顯微鏡(日本Nikon公司),酶聯(lián)免疫檢測儀(BIORAD smartspec 3000型),電子精密天平(上海精密科學儀器有限公司),熒光定量PCR儀(ABI 7300)、Effendorf 冷凍離心機。

        1.2 試藥

        川芎、鱉甲、海藻,購自康美藥業(yè)股份有限公司。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學中藥學院中藥鑒定教研室鑒定后使用。稱取川芎、鱉甲、海藻各20 g,分別置于1000 ml圓底燒瓶中,以10倍量水回流提取兩次,每次1.5小時,濾過,洗滌濾渣,合并兩次過濾液和洗滌液,濃縮至1.5 g·ml-1、1.0 g·ml-1、0.5 g·ml-1,分別為高、中、低濃度藥液,置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

        鹽酸阿霉素,浙江海正藥業(yè)股份有限公司,批號:09015,臨用前用生理鹽水配制為1 mg·ml-1;福辛普利鈉片,施貴寶制藥有限公司,批號:H20090262,粉碎后用蒸餾水配制成0.33 g·ml-1的溶液。MMP-9酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒、TIMP-1酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒(美國RB公司)、First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)。

        1.3 動物分組、造模與給藥

        SD大鼠,60只,雌雄各半,180~220 g,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(粵檢證字2009A028)。

        隨機分為空白對照組、模型組、福辛普利鈉組、高、中、低濃度中藥組等6組,每組10只。各組動物腹腔注射2%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1麻醉,摘取左腎[5],空白對照組假手術(shù)。

        各組動物手術(shù)后7天,尾靜脈注射阿霉素5 mg·kg-1,20天后再給阿霉素3 mg·kg-1造模,空白對照組注射等體積生理鹽水。

        各組于第2次注射阿霉素后1天,按1 ml·100g-1·d-1灌胃,空白對照組及模型組給同體積蒸餾水,福辛普利鈉組給福辛普利鈉,各中藥組給相應(yīng)濃度藥液,共給藥8周。

        1.4 24小時尿蛋白定量檢測

        各組于第2、4、6、8周結(jié)束時收集24小時尿液,溴甲酚氯仿法測定24小時尿蛋白定量。

        1.5 MMP-9、TIMP-1檢測

        各組動物于末次給藥1小時后,斷頭取血,常規(guī)方法取血清,另開腹腔取腎臟。

        MMP-9的檢測:取上述各組血清,按 MMP-9 ELISA試劑盒要求操作,培養(yǎng)板各孔加100 μl Assay Diluent RD1-34,每孔加100 μl標準品、樣品,孵育2小時,棄去上清,400 μl Buffer洗液·孔-1,清洗4次,加MMP-9二抗孵育1小時,棄去上清,400 μl Buffer洗液·孔-1,清洗4次。每孔加顯色液200 μl,避光室溫孵育30 分鐘,加終止液終止反應(yīng),用酶標儀檢測450 nm處的吸光度OD值。

        TIMP-1的檢測:取上述各組血清,按酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒要求操作,將TIMP-1 McAb分別滴加在培養(yǎng)板孔內(nèi),100 μl·孔-1,4℃過夜后棄去上清,用0.05%(V/V)Tween-20PBS(PBST)洗板3次,每次3分鐘;拍干后加含15%小牛血清的PBS,200 μl·孔-1,4℃過夜后棄去上清,PBST洗滌3次,每次3分鐘。將標準品、樣品加于包被孔內(nèi),37℃孵育1小時,PBST洗板5次,拍干后加HRP-抗TIMP-1二抗100 μl·孔-1,37℃孵育30分鐘,PBST洗板5次,徹底拍干后加入TMB顯色劑,50 μl·孔-1,37℃孵育15分鐘,加2 mol H2SO4 50 μl·孔-1終止反應(yīng),用酶標儀檢測450 nm處的吸光度OD值。

        1.6 實時熒光定量PCR檢測細胞TGF-β1mRNA

        1.6.1 總RNA提取

        取100 mg腎臟組織,按試劑盒要求操作,加入TRIzol反復吹打裂解細胞,用氯仿、異丙醇、75%乙醇分離、純化 RNA,最后用DEPC水溶解,紫外分光光度法檢測總RNA濃度及純度,置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

        反應(yīng)體系為20 μl,各組分終濃度分別為dNTP 1 mmol·L-1、Oligo(dT)18引物2.5 nmol·L-1、M-MlV逆轉(zhuǎn)錄酶10 U·μl-1、總RNA樣品0.2 ng~200 ng,DEPC水加至20 μl;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)為70℃孵育30分鐘,冰上放置2分鐘,37℃孵育5分鐘,42℃孵育60分鐘,70℃孵育10分鐘,所得產(chǎn)物cDNA用于實時熒光定量PCR。

        1.6.3 實時熒光定量PCR

        所用的目的基因引物及內(nèi)參照GAPDH引物均委托 invitrogen 公司合成。引物序列:TGF-β1上游引物5’-tacagggctttcgcttcagt-3’,下游引物5’-gttggtatccagg gctctcc-3’,產(chǎn)物長度 209 bp;GAPDH上游引物5’-ctcccattcctccacctttg-3’,下游引物5’-ccaccaccctgttgctgtag-3’,產(chǎn)物長度 110 bp。反應(yīng)體系為20 μl:2 μl cDNA,1 μl SYBR Green I 熒光染料,1 mmol dNTP,1μmol·L-1上、下游引物,5U·μl-1Taq酶,DEPC水加至20 μl,混勻。PCR反應(yīng)條件:95℃預變性5分鐘,95℃變性45秒,56℃退火45秒,72℃延伸20秒,熱循環(huán)40次,72℃延伸5分鐘。

        1.6.4 實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析方法

        按照2-△△Ct相對定量方法分析,目的基因和參照基因擴增效率都接近100%,具有一致性?!鰿t=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因),△△Ct=△Ct(處理組)-△Ct(空白對照組),取100倍2-△△Ct數(shù)值進行比較。

        1.7 統(tǒng)計學方法

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠24小時尿蛋白定量結(jié)果

        各中藥組均能減少腎小球硬化大鼠24小時尿蛋白(P< 0.05),見表1。

        2.2 各組大鼠MMP-9、TIMP-1表達的比較

        各中藥組均能有效上調(diào)MMP-9的表達,下調(diào)TIMP-1的表達,提高MMP-9/ TIMP-1的比值(P< 0.05),其中中劑量組效果最為顯著(P< 0.01),見表2。

        2.3 各組大鼠TGF-β1 mRNA表達的比較

        各中藥組均能抑制腎小球硬化大鼠TGF-β1mRNA的表達(P< 0.01);其中以中劑量組效果最顯著,見表3,圖1。

        表1 各組大鼠24小時尿蛋白定量比較

        表2 各組大鼠MMP-9、TIMP-1表達的比較

        表3 各組大鼠TGF-β1mRNA表達的比較

        圖1 各組大鼠TGF-β1mRNA表達的比較

        3 討論

        細胞外基質(zhì)ECM的降解過程中發(fā)揮重要作用的是MMPs-TIMPs系統(tǒng),其中,MMP-9可降解ECM中主要成分,減少ECM沉積,而TIMP-1可抑制MMP-9的降解作用,因此,MMP-9表達降低或TIMP-1表達增高,均可使MMP-9/TIMP-1的比值失調(diào),從而加速腎小球硬化的形成。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1在腎小球硬化的形成過程中也起著非常關(guān)鍵的作用,TGF-β1既能促進ECM合成增加,同時又抑制ECM的降解,最終導致ECM聚積,形成腎小球硬化。因此,本研究觀察各藥物組對腎小球硬化大鼠MMP-9、TIMP-1、TGF-β1mRNA的表達及MMP-9/TIMP-1比值的調(diào)節(jié),評價各組中藥對ECM降解調(diào)控系統(tǒng)的影響。

        中國古代醫(yī)籍中沒有“腎小球硬化”的表述,但根據(jù)其發(fā)展過程中的臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點,該病可歸屬于 “水腫”、“虛勞”、“腎勞”、“癃閉”等病癥范疇。該病絡(luò)氣郁滯[9],瘀血痰濕凝滯腎絡(luò)而致“腎絡(luò)癥積”,腎臟組織的病理改變,如細胞外基質(zhì)積聚、血管拌閉塞、球囊粘連、局灶或節(jié)段性腎小球硬化等,都可歸屬于“腎絡(luò)癥積”的范疇。

        本實驗采用單側(cè)腎切除加注射阿霉素造模法,建立腎小球硬化大鼠模型,實驗表現(xiàn)為蛋白尿和腎功能低下。實驗選取福辛普利鈉作為腎臟保護的陽性對照組,福辛普利鈉屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑,通過抑制血管緊張素Ⅱ的生成、阻斷腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)作用,及抑制緩激肽降解、增強緩激肽效應(yīng);同時可以減少尿蛋白排泄等,拮抗腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化而延緩腎損害進展。通過川芎、鱉甲、海藻相互配伍,針對腎絡(luò)之“痰、瘀、癥積”,在祛瘀、化痰的同時,配伍散結(jié)消癥之品以增強消癥化積之力,以期“痰瘀同治、癥結(jié)并消”。實驗結(jié)果提示該復方能減少腎小球硬化大鼠24小時尿蛋白(P<0.01),抑制TIMP-1的表達(P< 0.05),上調(diào)MMP-9活性(P< 0.05);中劑量組可同時下調(diào)TGF-β1mRNA表達(P< 0.01);可能通過對ECM系統(tǒng)的調(diào)控,產(chǎn)生對腎小球硬化大鼠腎功能的保護作用。 綜上所述,“腎絡(luò)癥積”理論指導下的祛瘀化痰、散結(jié)消癥中藥復方,為中醫(yī)藥臨床治療腎小球硬化,提供新的思路,但仍需進一步研究。

        [1] Klahr S,Morrissey JJ. The role of vasoactive compounds, growth factors and cytokines in the progression of renal disease[J]. Kidney Int,2000,75(S):7-14.

        [2] 彭爽,曹文富. 中藥防治腎纖維化的實驗研究進展[J]. 中國藥房,2010,21(7):666-668.

        [3] 雷鳳英,覃遠漢,裴娟,等. 基質(zhì)金屬蛋白酶及金屬蛋白酶組織抑制因子-1在腎小球硬化大鼠中的表達和意義[J]. 實用兒科臨床雜志, 2007,22(23):1812-1813.

        [4] Ostendorf T,Kunter U,van Roeyen C,et al. The effects of platelet-derived growth factor antagonism in experimental glomerulo-nephritis are independent of the transforming growth factor-beta system[J]. J Am Soc Nephrol,2002,13(3):658-667.

        [5] 段曉虹,董競成,何立群,等.補腎活血方對腎小球硬化大鼠的細胞外基質(zhì)狀態(tài)的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,30(11):1197-1200.

        [6] 杜聯(lián),殷麗平,楊彥,等. 川芎嗪聯(lián)合貝那普利對GK大鼠腎間質(zhì)MCP-1和TGF-β1表達干預的實驗研究[J]. 瀘州醫(yī)學院學報,2009,32(5):479-481.

        [7] 范煥芳,陳志強,張雪娟,等. 鱉甲煎丸對人腎小球系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)表達的影響[J]. 中成藥,2007,29(2):183-186.

        [8] 薄守波,鞠建偉,李建遠,等.褐藻多糖硫酸酯對人腎小球系膜細胞增殖及纖連蛋白與轉(zhuǎn)化生長因子分泌的影響[J]. 中華腎臟病雜志, 2006,22(10):638-639.

        [9] 王永鈞,張敏鷗. 痰瘀互結(jié)與腎內(nèi)微型癥積[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2003,4(1):1-3.

        猜你喜歡
        福辛普利鈉孵育
        血清N末端B型利鈉肽在識別川崎病冠狀動脈損傷中的研究進展
        血漿B型利鈉肽在慢性心衰診斷中的應(yīng)用
        三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
        中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
        Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
        大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
        中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
        卡維地洛與福辛普利聯(lián)合治療慢性心衰療效分析
        心房利鈉肽原不同肽段的抗腫瘤機制
        福辛普利拉血藥濃度的LC-MS/MS法測定及其人體藥動學研究
        藥學進展(2012年3期)2012-01-12 12:22:04
        血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑福辛普利的研究
        重組人腦利鈉肽素治療急性心力衰竭療效觀察
        国产激情无码Av毛片久久| 国产精品久久久久精品一区二区| 欧美极品jizzhd欧美| 手机看片福利日韩| 国产精品一级av一区二区| 国产精品人妻熟女男人的天堂| 男女性杂交内射妇女bbwxz| 99久久国产综合精品麻豆| 亚洲欧洲日产国码久在线| 日韩中文字幕在线丰满| 初尝人妻少妇中文字幕| 亚洲欧美日韩在线一区| 无码一区二区三区在| 精品极品视频在线观看| 国产欧美日韩精品丝袜高跟鞋| 两个人看的www高清视频中文| 五月天婷婷一区二区三区久久 | 精品无码AV无码免费专区| 精品人妻一区二区三区av| 欧美高清精品一区二区| 久久水蜜桃亚洲av无码精品麻豆 | 天天摸夜夜摸夜夜狠狠摸| 5级做人爱c视版免费视频| 久草精品手机视频在线观看| 日本a级免费大片网站 | 亚洲一本大道无码av天堂| 国产精品女同久久免费观看| 亚洲成人一区二区三区不卡| 国产肉体xxxx裸体137大胆| 欧美日韩综合网在线观看| 青青草久热手机在线视频观看 | 色噜噜久久综合伊人一本| 青青视频一区| 人妻熟女中文字幕在线视频| 巨爆中文字幕巨爆区爆乳| 久久综合久久鬼色| 欧美综合区自拍亚洲综合| 全亚洲高清视频在线观看| 欧美性色黄大片手机版| 久久精品国产99久久丝袜| 精品女人一区二区三区|