韋 敏，鄭生智，馬 紅，呂 曄

（1.中國(guó)科學(xué)院江蘇省植物研究所，江蘇 南京210014；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210029）

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，其病死率為婦科腫瘤之首，嚴(yán)重威脅著婦女的健康和生命安全。對(duì)卵巢癌的診治中醫(yī)學(xué)雖積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，但還未見(jiàn)枸杞子及其成分對(duì)其治療的研究。枸杞子為茄科植物寧夏枸杞(Lycium Barbarum L.)的干燥成熟果實(shí)，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，一直被用為強(qiáng)身健體之補(bǔ)藥。枸杞子含有枸杞多糖、多種氨基酸、微量元素、維生素、?；撬帷⑸飰A、揮發(fā)油等化學(xué)成分。一般認(rèn)為，枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP)為 其 活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明枸杞多糖能改善性功能、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗疲勞等[1-7]，臨床廣泛用于降低血脂血糖、保肝、抗腫瘤、抗衰老等。建立人癌裸鼠模型是研究人類(lèi)腫瘤生物學(xué)行為和抗腫瘤治療的重要基礎(chǔ)方法之一。本研究觀察枸杞多糖對(duì)人卵巢癌裸鼠干預(yù)后的IGF家族中部分指標(biāo)的變化以期了解枸杞多糖對(duì)卵巢癌的作用機(jī)制?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 BALB/c，nu/nu裸小鼠，4～6周齡，雌性，40只體質(zhì)量18～20 g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPE）條件下飼養(yǎng)，合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005號(hào)。人卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 藥物 枸杞多糖（40%）購(gòu)買(mǎi)于上?？抵壅婢嗵怯邢薰荆梭w推薦攝入量132 mg/（人·d），即2.2 mg/（kg·d）。

1.1.3 試劑 美國(guó)ADL goat anti-rat Total Insulin Growth Factor 1 Elisa測(cè)定試劑盒 (No.QRCT-3013331110331EIAUTL)，美國(guó)ADL goat anti-rat Insulin like Growth Factor Receptor Elisa測(cè)定試劑盒 (No.QRCT-301110202331EIAUTL)， 美 國(guó)ADL goat anti-rat Total Insulin like Growth Factor Binding Protein 1 Elisa測(cè)定試劑盒 (No.QRCT-3013321332202EIAUTL)由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 儀器 Labsystems Finnpipette 100μL單道移液器；Thermo 50μL 8道移液器；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；華東電子DG5033A酶標(biāo)儀（南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3，常規(guī)方法復(fù)蘇，接種于含10%小牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)液(10.2 g PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基加入800 mL雙蒸水中，攪拌至完全溶解，然后加入NaHCO32 g，再加雙蒸水定容至1 000 mL，0.22μm微孔濾膜除菌，分裝后4℃存放。用前調(diào)pH值，加入加熱滅活的小牛血清至終濃度為10%，加入青鏈霉素使其終濃度分別為100μg/mL)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層后用0.25%胰蛋白酶(先將4 g胰酶加入100 mL 0.02%EDTA配成濃度為4%儲(chǔ)存液，過(guò)濾除菌，4℃存放。然后用高壓滅菌的1×PBS 40倍稀釋)消化傳代，大量擴(kuò)增細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞總數(shù)達(dá)到要求時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以胰酶消化，PBS液洗滌2次，低速離心800 r/min，15 min，制成1×107個(gè)/mL細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 腫瘤模型的制備 由于卵巢癌復(fù)發(fā)病灶主要位于盆腹腔，故可以利用卵巢癌細(xì)胞腹腔種植于BABL/c雌性裸鼠建立荷人卵巢癌裸鼠腹腔種植瘤模型。取4～6周的BABL/c雌性裸鼠，體質(zhì)量(18.2±1.6)g，腹腔內(nèi)注射含卵巢癌細(xì)胞的NS，注射后每日稱(chēng)體質(zhì)量，對(duì)因腫瘤致死的裸鼠，進(jìn)行腹膜、心、肝、脾、腎、肺、腸、卵巢、子宮、橫膈和網(wǎng)膜的組織學(xué)檢查，證實(shí)其致癌性，提示造模是成功的。

1.2.3 給藥方法及分組 隨機(jī)取4～6周的BABL/c雌性裸鼠8只作空白組。32只取腹腔內(nèi)注射1×107卵巢癌細(xì)胞4周后的BABL/c雌性裸鼠隨機(jī)分為共4組，模型組灌服生理鹽水、枸杞多糖高、中、低劑量組分別為30、20、10 mg/kg；給藥劑量均按成人每日60 kg體表面積換算（以下簡(jiǎn)稱(chēng)高、中、低3個(gè)劑量組、空白組和模型組）。分別稱(chēng)取樣品50、100、150 mg加純凈水至100 mL配制成3個(gè)不同濃度受試物（隔日配制），空白組和模型組給予純凈水，各組每日以20 mL/kg灌胃，連續(xù)30 d。

1.2.4 IGFBP-1、IGFR的測(cè)定 給予受試物結(jié)束后，禁食12 h，處死動(dòng)物取血清冷凍于-20℃，用于測(cè)定血清IGF-Ⅰ水平（由于血清量少，IGFR水平無(wú)法測(cè)定），同時(shí)快速取出卵巢組織速凍于液氮中，用于測(cè)定IGFBP-1和IGFR水平。

1.2.5 血清胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-Ⅰ）測(cè)定 直接取血清100μL，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。1.2.6 裸鼠卵巢組織蛋白含量的測(cè)定(考馬斯亮蘭法) 準(zhǔn)確稱(chēng)取組織質(zhì)量，每個(gè)樣本加入300μL的生理鹽水在冰浴中勻漿5 min，2 500 r/min，離心10 min，取上清液再用生理鹽水稀釋按照1∶4的組織勻漿待測(cè)。按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，于595 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。

1.2.7 卵巢組織中胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（IGFBP-1）測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取組織質(zhì)量，每個(gè)樣本加入300μL的生理鹽水在冰浴中勻漿5 min，2 500 r/min，離心10 min，取上清液組織勻漿待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.8 卵巢組織中胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（IGFR）測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取組織質(zhì)量，每個(gè)樣本加入300μL的生理鹽水在冰浴中勻漿5 min，2 500 r/min，離心10 min，取上清液組織勻漿待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 8.0軟件t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以“±s”表示。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對(duì)人卵巢癌裸鼠血清IGF-Ⅰ水平的影響

模型組血清中IGF-Ⅰ水平提示與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功。高、中、低3個(gè)劑量的枸杞多糖能降低腫瘤引起的IGF-Ⅰ水平的升高，與空白組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 枸杞多糖對(duì)人卵巢癌裸鼠血清IGF-Ⅰ水平的影響 （±s，n=8）

表1 枸杞多糖對(duì)人卵巢癌裸鼠血清IGF-Ⅰ水平的影響 （±s，n=8）

注：與模型組比較*P＜0.01；與空白組比較ΔP＜0.01。下同。

組 別空白組模型組高劑量組中劑量組低劑量組劑量(mg/kg)--30 20 10 IGF-Ⅰ（ng/mL）220.082 4±11.401 7 290.231 8±12.179 4Δ 247.341 1±10.034 6*251.435 6±13.598 1*264.121 6±11.255 3*

2.2 枸杞多糖對(duì)人卵巢癌裸鼠卵巢組織IGFBP-1和IGF-ⅠR水平的影響

模型組卵巢組織中IGFBP-1及IGFR水平均顯示與空白組有極顯著性差異（P＜0.01），提示造模成功。高、中、低3個(gè)劑量的枸杞多糖能升高由于腫瘤引起的IGFBP-1表達(dá)的下調(diào)，與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高、中劑量組枸杞多糖與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組枸杞多糖與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高、中、低3個(gè)劑量的枸杞多糖能降低腫瘤引起的IGFR水平的升高，與空白組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 枸杞多糖對(duì)人卵巢癌裸鼠卵巢組織IGFBP-1和IGFR水平的影響 （±s，n=8）

表2 枸杞多糖對(duì)人卵巢癌裸鼠卵巢組織IGFBP-1和IGFR水平的影響 （±s，n=8）

組 別空白組模型組高劑量組中劑量組低劑量組劑量(mg/kg)--30 20 10 IGFBP-1（ng/mg）27.722 3±2.390 9 11.162 0±1.387 7Δ 15.213 4±1.342 1*17.006 7±3.076 1*16.579 7±1.389 9*IGFR（ng/mg）6.944 3±0.938 6 13.025 6±0.561 9Δ 7.205 8±0.221 7*7.633 0±0.566 7*7.488 9±0.432 6*

3 討論

IGF家族對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡有著重要作用，IGF系統(tǒng)包括2個(gè)多肽類(lèi)生長(zhǎng)因子（IGF-Ⅰ、IGF-ⅠI）、兩類(lèi)受體（IGF-ⅠR、IGF-ⅠIR）、IGF高親和力的IGFBP1-6以及新發(fā)現(xiàn)的至少9種低親和力的IGFBP相關(guān)蛋白（IGFBP-rPs）、IGFBP蛋白酶及其他幾個(gè)與IGFBP相互作用的分子[8]。

IGF-Ⅰ是含70個(gè)氨基酸的多肽，在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均具有強(qiáng)有絲分裂活性。除了刺激細(xì)胞增殖以外，它還能抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些活性均通過(guò)與其特異性受體(IGFR)結(jié)合而發(fā)揮作用。血清IGF-Ⅰ的增高為腫瘤表型的一部分，大多數(shù)腫瘤都需要IGF-Ⅰ來(lái)維持其增殖和生長(zhǎng)[9]，這也和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。本實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤模型組相比較空白組血清IGF-Ⅰ水平有顯著性升高，可見(jiàn)IGF-Ⅰ通過(guò)腫瘤細(xì)胞自分泌或旁分泌的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、生長(zhǎng)。

IGF-ⅠR與細(xì)胞生長(zhǎng)分化、胚胎發(fā)育有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞向惡性表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的形成和生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)顯示腫瘤模型組IGF-ⅠR水平上升與此理論吻合，故若能下調(diào)IGF-ⅠR可抑制腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并可致細(xì)胞凋亡。

還未有研究考察腫瘤模型中IGFBP-1水平，本課題組考慮IGF結(jié)合蛋白中IGFBP-1具有特殊作用，不僅能與IGF-Ⅰ結(jié)合，控制IGF-Ⅰ運(yùn)輸、代謝及分布，還能間接地調(diào)節(jié)葡萄糖及胰島素水平，并具有獨(dú)立于IGF之外針對(duì)血管平滑肌及生殖系統(tǒng)的作用，故考察了IGFBP-1水平。本研究結(jié)果IGFBP-1作為生長(zhǎng)抑制因子，其在腫瘤模型中出現(xiàn)水平的下調(diào)。

不同劑量的枸杞多糖能明顯升高卵巢組織中IGFBP-1水平，降低IGF-Ⅰ和IGFR水平，提示枸杞多糖通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化來(lái)積極對(duì)抗卵巢癌，但具體作用機(jī)制和IGFBP-1在卵巢組織中的作用尚需進(jìn)一步研究。

[1]蔣萬(wàn)志，張洪泉.枸杞多糖在免疫和抗衰老方面的研究進(jìn)展[J].中國(guó)野生植物資源，2010，(2)：5-7,14.

[2]吳 琦，李志強(qiáng)，崔忠慧.枸杞多糖降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究進(jìn)展[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(2)：67-69.

[3]左紅舉，喇萬(wàn)英.枸杞多糖的降血糖作用及對(duì)糖尿病并發(fā)癥的研究現(xiàn)狀和展望[J].甘肅中醫(yī)，2009，22(4)：77-79.

[4]陶大勇.枸杞多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(22)：6 816-6 818.

[5]顧云燕，吳瑾瑾.枸杞多糖抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2007，9(9)：1 255-1 256.

[6]羅 瓊，閻 俊，張聲華.枸杞多糖的分離純化及其抗疲勞作用[J].衛(wèi)生研究，2000，29(2)：115-117.

[7]黃曉蘭，楊明亮，吳曉曼，等.枸杞多糖對(duì)大鼠生殖系統(tǒng)保護(hù)作用的機(jī)制探討[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(1)：29-31.

[8]Grimberg A,Cohen P.Role of insulin-like growth factors and their binding proteins in growth controls and carcinogenesis[J].J Cell Physiol,2001,183(1)：1-9.

[9]Y-F Huang,M-R Shen,K-F Hsu,et al.Clinical implications of insulin-like growth factor 1 system in early-stage cervical cancer[J].British Journal of Cancer,2008,（99）：1 096-1 102.