湯依群 尹月淼 黃 潞 汪旻暉 于雪莉 徐 靜

（中國藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室，江蘇 南京 210009）

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）是臨床上最為常見的快速性心律失常，可引起血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變和腦栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥，AF已成為心律失常領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

關(guān)白附為中藥毛莨科黃花烏頭Aconitum coreanum（Levl,） Rapaics的塊根，主治心痛血痹，具有祛風(fēng)，燥濕，化痰，止痛作用[1,2]，化學(xué)成分主要有關(guān)附庚素 （Guanfu base G，GFG），關(guān)附甲素 （Guanfu base A，GFA），關(guān)附壬素 （Guanfu base I，GFI） 等，其中關(guān)附甲素為首次發(fā)現(xiàn)的全新結(jié)構(gòu)類型的安全、有效的廣譜抗心律失常一類新藥，已獲得國家新藥證書和生產(chǎn)批文。我們以關(guān)白附總生物堿提取物為有效部位，控制總生物堿含量達(dá)50%以上，在國家新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)基金支持下，進(jìn)行抗房顫口服制劑的開發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)選用尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液制備大鼠心房顫動(dòng)模型[3]，結(jié)合western-blot實(shí)驗(yàn)，觀察關(guān)白附總堿鹽抗房顫作用。

1 材料與方法

受試藥：關(guān)白附總堿鹽，編號(hào)2010-0505，（GFI 2.7%，GFA 82.9%），中國藥科大學(xué)劉靜涵教授提供，乙酰膽堿，決奈達(dá)隆，純品，Sigma；其余試劑市售，分析純。

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

雄性SD大鼠，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（滬）2008-0016。隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常，造模，治療組。 正常組大鼠10只，iv 生理鹽水7d。其余大鼠10%水合氯醛麻醉，尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液（0.1gCaCl2+6.6μgACh/10mLH2O，0.1mL/100g），每天一次，第四天，隨機(jī)分成①模型組、②關(guān)白附總堿鹽口服低劑量（5mg/kg）、③中劑量（15mg/kg）、④高劑量（45mg/kg）和決奈達(dá)隆組（1mg/kg，ip）。藥物治療3d。

1.2 AF 持續(xù)時(shí)間測(cè)定與ECG 參數(shù)的測(cè)量

大鼠麻醉，在ECGⅡ監(jiān)測(cè)下靜脈注射Ach-CaCl2誘發(fā)房顫，對(duì)照組大鼠麻醉后注射生理鹽水，以出現(xiàn)房顫f波及P波消失為典型房顫心電圖，以恢復(fù)竇性心律及f波消失，P波出現(xiàn)為房顫終止。計(jì)算大鼠造模后房顫持續(xù)時(shí)間。于實(shí)驗(yàn)第1天，第4天和第7天造模完成30min后記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖，計(jì)算QTc。

1.3 大鼠心房肌有效不應(yīng)期測(cè)定

如文獻(xiàn)[4]描述，每組取8只大鼠在實(shí)驗(yàn)第8天進(jìn)行ERP測(cè)定。

1.4 Western-blot 法測(cè)定大鼠心房組織縫隙連接蛋白Cx40的表達(dá)

造模結(jié)束后，取大鼠心房，加入RIPA裂解液（Biouniquer），剪碎勻漿離心后提取總蛋白。Bradford法定量。樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，4 ℃孵育一抗過夜 （兔抗Cx40一抗，美國Santa Cruz 公司；鼠抗GAPDH一抗，Bioworld公司） 。

TBST洗膜，二抗室溫?fù)u床孵育 （HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗Biouniquer公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗，北京原平皓生物）。HRP-ECL法顯色（ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，Biouniquer 公司），X線膠片感光，掃描，Quantity One 4.6.2 凝膠圖像分析軟件分析，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平，重復(fù)三次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 關(guān)白附 (關(guān)1)對(duì)大鼠QTc的影響（ ±s，n=6）

表2 關(guān)白附 (關(guān)1)對(duì)大鼠QTc的影響（ ±s，n=6）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs給藥前后；##P＜0.01 vs 造模第一天。

QTc D1前 D1后 D4前 D4后 D7前 D7后model 0.178±0.004 0.172±0.004 0.172±0.004 0.17±0.004*## 0.161±0.006## 0.157±0.005*##關(guān)1低 0.168±0.007 0.165±0.007 0.192±0.009## 0.187±0.009**## 0.198±0.009## 0.186±0.008**##關(guān)1中 0.183±0.009 0.174±0.007 0.196±0.006## 0.189±0.008*## 0.204±0.007## 0.184±0.01*##關(guān)1高 0.168±0.003 0.168±0.011 0.193±0.01# 0.178±0.006* 0.211±0.019# 0.193±0.005#決奈 0.172±0.006 0.171±0.004 0.198±0.006## 0.193±0.006## 0.215±0.007## 0.204±0.006*##

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠尾靜脈注射藥液（CaCl210 mg/mL，ACh 66μg/mL），誘導(dǎo)出典型大鼠房顫心電圖：P波消失，f波出現(xiàn)，R-R間期不等，可自行恢復(fù)竇性心率。連續(xù)造模7d，大鼠房顫持續(xù)時(shí)間逐漸延長，心房ERP縮短。關(guān)白治療組，房顫持續(xù)時(shí)間縮短，ERP延長至正常水平，見圖1、圖2和表1。

圖1 正常和房顫大鼠II導(dǎo)聯(lián)心電圖

表1 關(guān)白附2010至0505（關(guān)白1）對(duì)房顫大鼠左心房ERP（ms）的影響（±s，n=6）

表1 關(guān)白附2010至0505（關(guān)白1）對(duì)房顫大鼠左心房ERP（ms）的影響（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01，與正常組比較；# P＜0.05，##P＜0.01，與模型組比較

組別 正常 模型 關(guān)白1低 關(guān)白1中 關(guān)白1高 決奈ERP 77.4±5.3 65.3±3.6**78.8±2.7##80.8±2.3##81±5.3##76.3±2.9##

圖2 關(guān)白附總堿鹽對(duì)大鼠房顫時(shí)間的影響（±s，n=6）

2.2 關(guān)白附對(duì)房顫大鼠復(fù)極參數(shù)QTc和左心房ERP的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。大鼠造模7d，左心房ERP縮短，提示電重構(gòu)形成，關(guān)白附治療后，心房ERP有效延長，心室復(fù)極參數(shù)回復(fù)到正常水平。

2.3 房顫大鼠心房組織Cx40蛋白表達(dá)的變化

與正常組相比，模型大鼠心房肌中Cx40含量下降（P＜0.01），關(guān)白附治療組，能有效保護(hù)Cx40蛋白表達(dá)，維持心房電信號(hào)同步。Western 原始圖和表達(dá)結(jié)果如圖3所示。

圖3 關(guān)白附保護(hù)心房Cx40蛋白表達(dá)

3 討 論

AF疾病發(fā)生發(fā)展中存在“房顫致房顫”（AF begets AF）現(xiàn)象[5]，即房顫持續(xù)慢性存在，能夠引起心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，形成房顫基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)研究顯示，心房持續(xù)性顫動(dòng)，可引起心房體積增大、心房纖維化等結(jié)構(gòu)改變。電重構(gòu)主要表現(xiàn)為心房有效不應(yīng)期（atrial effective refractory period，AERP）縮短和不應(yīng)期頻率適應(yīng)性降低。心房發(fā)生電重構(gòu)后，可促使AF發(fā)作頻率增多、發(fā)作時(shí)間延長，甚至不能自行轉(zhuǎn)復(fù)。目前認(rèn)為，異位興奮灶只是AF發(fā)生的觸發(fā)機(jī)制，而AF得以維持，有賴于心房電和結(jié)構(gòu)重構(gòu)的基質(zhì)即房顫基質(zhì)[6]。AF電重構(gòu)成為人們研究的熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)以左心房ERP值作為電重構(gòu)功能性指標(biāo)，觀察關(guān)白附抑制房顫引起的電重構(gòu)作用。

心電圖參數(shù)中，QT間期反映心室肌復(fù)極過程。QT間期受心率影響較大，心率加快，QT間期縮短。校正QT間期，即QTc，可消除心率引起的QT間期變化，被認(rèn)為是衡量心室復(fù)極過程較可靠指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，持續(xù)房顫刺激，模型組大鼠心室復(fù)極加快，QTc縮短。提示房顫模型大鼠，心室電生理特性適應(yīng)性改變。QT過度縮短，即SQT綜合癥，可誘發(fā)室性心律失常，是危險(xiǎn)的心律失常發(fā)生征兆。關(guān)白附治療后，可有效延長模型大鼠QTc，恢復(fù)心室電生理特性。

細(xì)胞間縫隙連接（gap junction，GJ）作為細(xì)胞間的一種特殊通道介導(dǎo)著細(xì)胞間電和化學(xué)信號(hào)的傳遞，在維持電和機(jī)械偶聯(lián)，以及確保心肌協(xié)調(diào)收縮方面起著重要作用[7]?？p隙連接蛋白40（connexin40，Cx40）主要分布在心房肌，是心房電激動(dòng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，Cx40表達(dá)和功能的改變，有助于維持局部微折返，導(dǎo)致持續(xù)性AF[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，關(guān)白附可有效提高房顫引起的Cx40表達(dá)下調(diào)，回復(fù)心房電傳導(dǎo)功能。

決奈達(dá)隆2009年FDA批準(zhǔn)上市，用于預(yù)防心房顫動(dòng)或恢復(fù)竇性心率，預(yù)防室性心動(dòng)過速和心室顫動(dòng)[8,9]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，關(guān)白附治療房顫作用與決奈達(dá)隆接近，本課題組藥動(dòng)學(xué)研究顯示，關(guān)白附口服片生物利用度大于80%（數(shù)據(jù)待發(fā)表），而決奈口服生物利用度僅15%，提示關(guān)白附口服制劑在抗房顫作用上具有廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。

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