黃芬香，楊春艷，龐春英，鄭海英，尚江華，張秀芳，梁賢威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西 南寧530001）

近年來，隨著水牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，商業(yè)性良種水牛胚胎的需求迅速加大。應(yīng)用活體采卵技術(shù)生產(chǎn)良種水牛胚胎，可反復(fù)從優(yōu)良性狀母畜體內(nèi)采集遺傳背景清楚的卵母細胞生產(chǎn)胚胎，充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力。但由于活體采卵技術(shù)回收到的良種水牛卵母細胞數(shù)量有限，且在活體采卵的過程中，通過真空泵的抽吸，不可避免地由于負壓的的作用剝脫卵母細胞周圍的卵丘細胞而產(chǎn)生較多的裸卵。在活體采卵回收到的卵母細胞中，卵母細胞可用率為70.92%，裸卵平均占回收總卵數(shù)的16.33%［1］。在這些裸卵中的一部分可能是AB級卵由于負壓作用剝脫而形成的，具有成熟發(fā)育的潛力，受精后仍能有發(fā)育成胚胎的可能。因此，若能將這些裸卵在體外培養(yǎng)成熟進行受精，可增加活體采集可用卵母細胞的數(shù)量，使卵母細胞資源得以充分利用，以提高良種水牛活體采卵——體外生產(chǎn)胚胎的效率。眾所周知，水牛體外受精是模擬體內(nèi)受精卵、胚胎發(fā)育條件和環(huán)境來進行的，過程復(fù)雜，體外受精效果受諸多因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細胞的存在與否嚴重影響卵母細胞的體外成熟質(zhì)量［2，3］及隨后的胚胎發(fā)育能力［4］。而在受精卵發(fā)育到胚胎的過程中，顆粒細胞具有重要的作用，與顆粒細胞制備的單層共培養(yǎng)可增強卵母細胞體外受精后發(fā)育到囊胚的能力［5］。本研究以屠宰本地水牛卵母細胞為研究對象，旨研究卵丘細胞對卵母細胞（包括裸卵）的體外成熟率、分裂率、囊胚發(fā)育率以及對比了不同牛品種顆粒細胞單層對水牛體外受精胚胎發(fā)育的影響，以探討裸卵利用的可能性，為提高良種水牛體外胚胎生產(chǎn)效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源與保存

水牛卵巢來自廣西南寧市屠宰場的成年母水牛卵巢，屠宰母水牛后取出卵巢，保存于35～37℃含有青、鏈霉素的生理鹽水保溫瓶中，在3h內(nèi)運回實驗室。水牛精液購自廣西畜禽品種改良站，保存于－196℃的液氮中。

1.2 試驗試劑

試劑均購自Sigma公司。洗卵液為含5%新生牛血清（NBS）和20mmol/L Hepes的 TCM199；體外成熟液為TCM199＋10%胎牛血清（FBS）＋50 μM 半胱胺＋10μg/mL FSH＋12U/mL LH＋1 μg/mL E2；洗 精 液 采 用 含 0.3% 牛 血 清 白 蛋 白（BSA）的改良 Tyrode＇S液；受精液為0.6%BSA＋60μg/mL肝素鈉的改良Tyrode＇S液；胚胎培養(yǎng)液為10%NBS＋TCM199。

1.3 試驗方法

以本實驗室建立的水牛卵丘卵母細胞的IVM、IVF和IVC 為基礎(chǔ)試驗方法［6，7］。

1.3.1 卵母細胞的收集 采用卵泡穿刺法從直徑2～8mm的明亮卵泡中吸取卵母細胞。在體視顯微鏡下挑選形態(tài)正常，周圍有完整或部分卵丘細胞且細胞質(zhì)均勻的卵母細胞以及形態(tài)正常的無卵丘卵母細胞進行成熟培養(yǎng)。

1.3.2 卵母細胞的體外成熟培養(yǎng) 將清洗好的卵母細胞移入成熟培養(yǎng)液中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中5%CO2、38℃條件下培養(yǎng)22～24h。取出部分COCs，用0.2%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細胞，觀察生發(fā)泡破裂和第一極體排出的情況，計算卵母細胞的成熟率。

1.3.3 體外受精 用受精液在培養(yǎng)皿中做20μL的受精微滴，上覆石蠟油，放入CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱平衡2h。精子上游法獲取活精子，待用。去除包裹在成熟卵母細胞周圍的部分卵丘細胞，只留1～2層。用受精液洗滌卵母細胞2～3次。將洗滌后的卵母細胞放入受精微滴中，每滴放入10個卵母細胞，再加入精子懸液，使得精子濃度為1.0～2.0×106個/mL。將含精卵的培養(yǎng)皿放回CO2培養(yǎng)箱中孵育20～24h。

1.3.4 胚胎的體外培養(yǎng) 精卵共育20～24h后，將受精卵周圍殘留的卵丘細胞吹打干凈，用胚胎培養(yǎng)液洗滌2次，轉(zhuǎn)入顆粒細胞單層微滴中置CO2培養(yǎng)箱，5%CO2、38.5℃和100%濕度條件下培養(yǎng)，20～24h后檢查分裂情況，培養(yǎng)過程中每隔48h半量更換培養(yǎng)液，每隔24h觀察胚胎發(fā)育情況。

1.3.5 試驗設(shè)計

試驗1：卵丘細胞對水牛卵母細胞體外受精及其胚胎發(fā)育的影響

將收集到的水牛卵母細胞分五組進行成熟培養(yǎng)。Ⅰ組為自然裸卵組：無卵丘細胞的AB級卵母細胞單獨進行成熟培養(yǎng)；Ⅱ組為共成熟組：無卵丘的AB級卵母細胞與顏色透明的片狀卵丘細胞塊進行成熟共培養(yǎng)；Ⅲ組為人為裸卵組：包裹卵丘細胞的AB級卵母細胞人為去除卵丘細胞后與顏色透明的片狀卵丘細胞塊進行成熟共培養(yǎng)。Ⅳ組為非裸卵組：包裹卵丘細胞的AB級卵母細胞進行體外成熟后去除卵丘細胞再進行體外受精，Ⅴ組為對照組，即包裹卵丘細胞的AB組卵母細胞單獨進行成熟培養(yǎng)。在各培養(yǎng)組的卵母細胞成熟培養(yǎng)22h后計算成熟率并進行體外受精及后續(xù)胚胎培養(yǎng)。

試驗2：不同牛品種顆粒細胞單層對受精卵共培養(yǎng)效果的比較。

AB級卵母細胞經(jīng)IVM、IVF后，在其受精20h后將假定受精的卵子分為兩組，分別與水牛、黃牛的顆粒細胞單層進行共培養(yǎng)。

水牛顆粒細胞單層的制備：從水牛卵巢回收液中挑選光澤度好、細胞致密的大塊顆粒細胞片，離心洗滌后將收集的顆粒細胞用胚胎培養(yǎng)液制成細胞密度為（1～2）×106個/mL的懸浮液，在60×15mm的塑料培養(yǎng)皿中做成30μL的微滴，并覆蓋石蠟油。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層后備用。

黃牛顆粒細胞單層：從屠宰場收集到的牛卵巢回收的卵泡液中挑選光澤度好、細胞致密的顆粒細胞碎片，培養(yǎng)液清洗2遍后，加入25%胰酶吹打1 min，離心（2500r/min，5min）洗滌2次，用胚胎培養(yǎng)液懸浮細胞，調(diào)整細胞密度為（1～2）×106個/mL，在60×15mm的塑料培養(yǎng)皿中做成30μL的微滴，并覆蓋石蠟油。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層后備用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 卵丘細胞對水牛卵母細胞體外受精及其胚胎發(fā)育的影響

從表1可以看出，各培養(yǎng)組卵母細胞在體外成熟培養(yǎng)22～24h后，在成熟率方面，自然裸卵組（Ⅰ組）與共成熟組（Ⅱ組）無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于人為裸卵組（Ⅲ組）（P＜0.05），極顯著低于非裸卵組（Ⅳ組）、對照組（Ⅴ組）（P ＜0.01）；共成熟組（Ⅱ組）較自然裸卵組（Ⅰ組）略有提高；人為裸卵組（Ⅲ組）與共成熟組（Ⅱ組）、非裸卵組（Ⅳ組）、對照組（Ⅴ組）均無明顯差異（P＞0.05），但顯著高于自然裸卵組（Ⅰ組）（P＜0.05）。在分裂率方面，自然裸卵組（Ⅰ組）、共成熟組（Ⅱ組）與人為裸卵組（Ⅲ組）無顯著差異（P＞0.05），但自然裸卵組（Ⅰ組）與非裸卵組（Ⅳ組）、對照組（Ⅴ組）差異極顯著（P＜0.01）。在囊胚率方面，自然裸卵組（Ⅰ組）極少出現(xiàn)胚胎，但與卵丘細胞共培養(yǎng)后囊胚率顯著提高（P＜0.05）；人為裸卵由于系人為去除卵丘細胞致裸卵，因此發(fā)育潛能明顯優(yōu)于自然裸卵（P＜0.01），但與Ⅱ組無差異；非裸卵組（Ⅳ組）因是由AB級卵經(jīng)成熟后去除卵丘細胞授精，效果優(yōu)于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，但這四組的囊胚率均極顯著差于對照組（Ⅴ組）（P＜0.01）。這表明，卵丘細胞無論是在體外成熟或是體外受精的過程中都起著舉足輕重的作用，但相對自然裸卵而言，雖然在與卵丘細胞共培養(yǎng)后成熟率、分裂率、囊胚率略有提高卻未能夠取得較理想的培養(yǎng)效果。

表1 卵丘細胞對水牛卵母細胞體外受精及其胚胎發(fā)育的影響

2.2 不同牛品種共培養(yǎng)細胞對水牛受精卵發(fā)育的影響

從表2可以看出，正常AB級卵母細胞細胞經(jīng)體外成熟和體外受精后，受精卵分別與黃牛顆粒細胞單層和水牛顆粒細胞單層進行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種顆粒細胞單層的分裂率和囊胚率差異顯著，水牛顆粒細胞單層的分裂率和囊胚率均明顯高于黃牛的（P＜0.05）。結(jié)果表明，應(yīng)用本培養(yǎng)系統(tǒng)，采用水牛顆粒細胞單層共培養(yǎng)組的效果較優(yōu)于黃牛顆粒細胞單層共培養(yǎng)組。

表2 不同牛品種共培養(yǎng)細胞對水牛受精卵發(fā)育的影響

3 討論

在水牛胚胎的體外生產(chǎn)中，卵丘細胞對于卵母細胞成熟有極其重要的作用［8］，主要表現(xiàn)在卵丘細胞參與維持卵母細胞減數(shù)分裂阻滯，誘導(dǎo)卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)、支持卵母細胞細胞質(zhì)的成熟［9］，并進而提高其受精后的卵裂率和發(fā)育率。已有實驗表明，在體外成熟的過程中，一些生長因子能不同程度地促進卵母細胞的體外成熟，提高成熟卵繼續(xù)發(fā)育的能力，但生長因子的作用，必須由卵丘細胞縫隙連接介導(dǎo)，對裸卵無作用［10］。本實驗研究也發(fā)現(xiàn)，自然裸卵在正常情況下培養(yǎng)，極少出現(xiàn)囊胚，但其與卵丘細胞共培養(yǎng)后，在成熟率、分裂率、囊胚率方面有所提高；機械裸卵，即假定的回收裸卵中的一部分，其有可能是卵母細胞回收過程中由于外部原因人為地打光卵丘細胞所致，這一部份機械致光的卵比自然裸卵更有發(fā)育潛力，因此，其發(fā)育效果較優(yōu)于自然裸卵。研究也證實了卵丘細胞不僅只是在體外成熟的過程中起著決定性的作用，在體外受精的過程中也發(fā)揮著重大作用，這也與 Fatechi［4］和 Li［11］等試驗證明卵丘細胞的存在有利于卵母細胞體外成熟及受精后發(fā)育的結(jié)論一致。非裸卵組，在AB級卵母細胞常規(guī)體外成熟后，機械打光后受精，雖然其發(fā)育結(jié)果比自然裸卵、自然裸卵共培養(yǎng)和機械裸卵要好，但仍然比對照組有較顯著的差異，這與在牛上的試驗結(jié)果基本一致［12］。其次，卵母細胞周圍的卵丘顆粒細胞能幫助精子獲能和穿入卵母細胞［13］，能夠明顯提高受精胚胎的發(fā)育［14，15］。因此本試驗的卵母細胞在受精時包裹卵丘細胞與成熟后打光卵丘細胞受精相比，明顯提高了水牛體外受精的卵裂率和囊胚率。

利用顆粒細胞單層共培養(yǎng)，有利于水牛體外受精卵的發(fā)育，但不同牛品種的顆粒細胞單層培養(yǎng)效果有所差異，這在本試驗中也得到了證實，應(yīng)用水牛顆粒細胞單層的共培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于黃牛顆粒細胞單層的培養(yǎng)效果。究其原因可能為，同科不同屬的顆粒細胞所產(chǎn)生的肝素結(jié)合細胞因子（midkine）和其它一些細胞因子對水牛胚胎體外發(fā)育能力雖然都有促進作用，都能除去培養(yǎng)液中某些對水牛胚胎發(fā)育不利的毒性代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的氧張力而阻止氧化應(yīng)激，穩(wěn)定培養(yǎng)液的各種生化參數(shù)，使水牛胚胎在一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中生長發(fā)育［16］，但作用與其在同屬的顆粒細胞各不相同，卵母細胞或者在與其相對應(yīng)的科屬的顆粒細胞單層中共培養(yǎng)效果更好。

4 結(jié)論

綜合結(jié)果看出，卵丘細胞雖對裸卵的體外成熟培養(yǎng)及其受精分裂效果沒有明顯的改進作用，但能顯著提高其囊胚率；卵丘細胞在AB級卵母細胞受精過程中的促進作用能顯著提高囊胚率。說明卵丘細胞有助于水牛卵母細胞的體外成熟、體外受精及其胚胎發(fā)育；在受精卵培養(yǎng)過程中，應(yīng)用同科屬的水牛顆粒細胞單層共培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于黃牛顆粒細胞單層的效果。

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