王麗宏 葉元土 張寶彤 蕭培珍 唐精 張波

我國水域遼闊，氣候多樣，漁業(yè)和生物資源豐富，是世界上水產(chǎn)業(yè)相對較發(fā)達的國家之一，這些豐富多樣的水生種質(zhì)資源為我國水產(chǎn)業(yè)及國民經(jīng)濟的快速發(fā)展提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。但隨著水產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，產(chǎn)生了一系列影響其健康發(fā)展的不利因素，如環(huán)境影響（病毒、細菌、代謝毒素等）、飼料保管不善（脂肪氧化、蛋白質(zhì)變性）、原料組分等，導致水產(chǎn)動物各種疾病的頻繁發(fā)生，嚴重影響了養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。到目前為止，我們對魚病的判斷還主要停留于定性描述，很難從實質(zhì)上作出定量分析。近年來，關(guān)于動物健康參數(shù)的調(diào)查在人和鼠上的研究相對較多，但在魚類方面尚未見文獻報道，因此，建立一套系統(tǒng)的適合養(yǎng)殖魚類的健康評價標準，已成為當前水產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個先導。

血清中各種生化指標比機體的理化組成能更快地反映組織的健康狀況和機體的代謝機能。本文主要側(cè)重研究了不同魚類間血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性。AST和ALT是反映肝臟健康狀態(tài)最敏感的酶學指標，對肝病的診斷治療具有重要價值。通過本研究，以期為其標準的建立提供一個前期的鋪墊，為我國漁業(yè)的健康、生態(tài)養(yǎng)殖，為養(yǎng)殖環(huán)境的改善等提供重要的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗魚

試驗用鳊魚 (Parabramis pekinensis)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、鯽魚(Carassius auratus)、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、鯉魚(Cyprinus carpio)、鏡鯉(mirror carp)、羅非魚(Tilapia)均為各地區(qū)主要養(yǎng)殖品種，其規(guī)格見表1。

1.2 采樣

試驗魚全部稱重，測量體長，隨即進行尾靜脈采血，離心（3500 r/min、10 min），分離血清，置液氮中低溫保存，用于血清ALT、AST活性的測定。同時，解剖、分離肝（胰）臟，迅速取其適量樣品放入波恩氏液（Bouin's）中固定，用于肝臟冰凍切片的制作，其余樣品放置低溫保存用于測定肝臟脂肪含量。

表1 不同地區(qū)幾種魚類間的生長情況

1.3 測定指標及分析方法

1.3.1 轉(zhuǎn)氨酶活性及肝（胰）臟脂肪含量

血清中天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)兩項生化指標均采用島津全自動生化分析儀進行分析測定。

肝胰臟樣品解凍后迅速采用恒溫105℃烘干失水法進行干燥，然后采用索氏脂肪提取法進行粗脂肪含量的測定。

1.3.2 肝（胰）臟冰凍切片

取適量固定（Bouin's）后的肝胰臟組織，修成規(guī)整的組織塊，包埋、修塊、切片，切片厚度為 2～3 μm、干片、染色（蘇木精、伊紅）、干燥、中性樹膠封片、干燥后進行觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對各項指標數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，計算平均值與標準差及參考范圍，結(jié)果用平均值±標準差（X±S）表示。

2 結(jié)果

2.1 不同地區(qū)各種魚類肝臟脂肪含量(見表2)

表2 幾種魚類間的肝（胰）臟脂肪含量

2.2 不同地區(qū)各種魚類血清轉(zhuǎn)氨酶情況

試驗測定了幾種魚類間的血清ALT、AST的指標，ALT、AST活性及ALT/AST區(qū)間范圍見表3、表4。

表3 幾種魚類間的血清轉(zhuǎn)氨酶活性范圍

表4 幾種魚類間的血清轉(zhuǎn)氨酶活性(U/l，X±S)

2.3 冰凍切片

解剖、分離肝臟，立即取部分肝臟組織，放入波恩氏液（Bouin's）中固定待用。取適當大小的組織塊進行修整、清洗、切片（3 μm）、干片、染色、中性樹膠封片、干燥、觀察拍照。部分魚的肝組織冰凍切片（A-D和A1-D1為互相對應(yīng)不同倍數(shù)下的同一尾魚,依次為鯉魚、草魚、鳊魚、黃顙魚、鯽魚，其中 A-D×100，A1-D1×400，黃顙魚的冰凍切片為表3數(shù)據(jù)中沒有包括在內(nèi)的病魚）見圖1。

由圖1可見，CC-1、DD-1肝臟存在明顯的脂肪化，特別是圖D、D-1更為嚴重，細胞邊界不清晰，肝臟細胞中充滿了脂肪滴，細胞質(zhì)嚴重破碎，細胞膜不完整，細胞核偏移甚至導致溶解消失，此外，還可見一些肝臟組織存在輕度的纖維化。

3 討論

血清AST和ALT是肝病診斷的重要指標，正常時血清中AST和ALT含量較低，因此，其活性變化對了解肝病狀況具有重要的意義。ALT絕大部分位于細胞漿，AST主要位于線粒體，肝損傷較輕時，僅限細胞膜的通透性增加，細胞漿內(nèi)的ALT釋放入血；在肝細胞受損嚴重時，線粒體里的AST釋放入血。因此，通過對兩種轉(zhuǎn)氨酶正常參考值的建立，以便更快速地對魚類肝病進行診斷，具有十分重要的意義。

圖1 部分魚的肝組織冰凍切片

由于我國各地自然環(huán)境的不同，各地魚類區(qū)系組成存在一定的差異。因此，試驗范圍涉及較廣，主要包括江蘇、河北、廣東、湖北等相關(guān)地區(qū)的主要品種，如草魚、鳊魚、鯉魚、鯽魚、黃顙魚、羅非魚等養(yǎng)殖魚類。由試驗結(jié)果可見，不同魚類間轉(zhuǎn)氨酶值存在一定差異，其中羅非魚的ALT、AST活性相對較大，而且不同地區(qū)的同一種魚類轉(zhuǎn)氨酶活性也存在差別，這可能與魚的品種、食性等具有一定的關(guān)聯(lián)，此外，不同地區(qū)的養(yǎng)殖模式也存在差異，不易達到條件的完全統(tǒng)一，且以上這些條件均會對動物的生理狀況產(chǎn)生影響。因此，為了更有效地分析評價，本試驗在對其血清生化指標檢測的同時，結(jié)合其肝臟組織學觀察。通過冰凍切片觀察可見，某些個體肝臟存在嚴重的脂肪化，如圖E/E1為黃顙魚，脂肪化較嚴重，且該個體對應(yīng)的脂肪含量為54.48%，AST和ALT活性分別為423 U/l、277 U/l，均明顯高于其均值 22.94±11.58%、(217.72±61.50)U/l、(18±5.94)U/l，具有一定的相關(guān)性。通過本試驗的初步調(diào)查，將為該標準的進一步建立和完善奠定一定的基礎(chǔ)。同時，結(jié)合各地區(qū)的養(yǎng)殖品種、管理狀況、飼養(yǎng)環(huán)境及養(yǎng)殖模式等，建立適合于該地區(qū)的生化指標參考標準，對動物的健康養(yǎng)殖和調(diào)控，將具有十分重要的現(xiàn)實意義。但由于影響動物血清生化指標的因素較多，當前的試驗研究正著手從細胞分子水平方面進行更深入的探討。

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