高旭東 陸蔭英 馮帆 王春平 王 常秀娟 楊永平

研究證實(shí)反轉(zhuǎn)座子LINE-1，又稱長散布核元件（Long Interspersed Nucleotide acids Element-1，L1），與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在正常成體組織和細(xì)胞中L1均處于沉默狀態(tài)，其主要相關(guān)機(jī)制是啟動子區(qū)的甲基化修飾和RNAi，但在生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞發(fā)育早期及腫瘤細(xì)胞中，L1啟動子發(fā)生去甲基化[1～3]，進(jìn)而被廣泛激活，引發(fā)反轉(zhuǎn)座的發(fā)生，并調(diào)控相關(guān)宿主基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)行為。此外，L1的表達(dá)與反轉(zhuǎn)座還能夠?qū)蚪M產(chǎn)生相當(dāng)?shù)钠茐?，如誘發(fā)突變和基因組的不穩(wěn)定性[3～5]，在大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中呈明顯高表達(dá)[6]，與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性密切相關(guān)[7]。人的L1基因長約6 kb，分別編碼開放讀碼框 -1p（open reading frame-1p，ORF-1p）和ORF-2p兩個蛋白。ORF-2p自身具有核酸內(nèi)切酶活性，能切割靶基因位點(diǎn)并以靶基因DNA為引物，以自身RNA為模板在其自身反轉(zhuǎn)錄酶活性作用下完成反轉(zhuǎn)座過程[7]；而ORF-1p則與RNA以及單鏈DNA有高親和力，是ORF-2p調(diào)節(jié)反轉(zhuǎn)座必要的伴侶，被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞中L1的高表達(dá)及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[8]。

本研究利用帶Flag標(biāo)簽的L1 ORF1p表達(dá)載體，研究在肝癌細(xì)胞SMMC7721中表達(dá)的ORF-1p對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性及肝癌相關(guān)調(diào)控蛋白報(bào)告基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L1 ORF1p能夠單獨(dú)發(fā)揮作用，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，為闡明各種腫瘤的發(fā)生機(jī)制開辟了一個新的思路。

材料與方法

一、細(xì)胞與試劑 肝癌細(xì)胞SMMC7721、大腸桿菌 DH5α、pCDNA3.0-Flag-ORF1、pCDNA3.0-Flag、p15-luc、p21-luc和p53-luc報(bào)告基因等由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院八所七室保存并提供。質(zhì)粒提取試劑盒和MTT為Ameresco公司產(chǎn)品。其他包括DMEM（Gibco公司）、胰酶（Ameresco）、特級胎牛血清（Gibco公司）、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑（LipofectAMINE 2000 Invitrogen公司）、抗L1-ORF1p單克隆抗體（本室自制）、兔抗GADPH 多克隆抗體（Sigma公司）和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG（Santa Cruz公司）等。

二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇SMMC7721細(xì)胞，接種到6cm平皿中，使用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2常規(guī)條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，使用Lipofectamine 2000按照說明書所述方法轉(zhuǎn)染pCDNA3.0-Flag-ORF1表達(dá)載體和相應(yīng)空載體，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。

三、Western blotting檢測細(xì)胞L1 ORF1p的表達(dá) 收集細(xì)胞，加入50μL SDS-裂解緩沖液，煮沸10 min變性，將上述變性的細(xì)胞總蛋白離心后取上清進(jìn)行12.5%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉（用1×TBST配制）于室溫下進(jìn)行封閉1h，然后加入兔抗ORF-1p單克隆抗體（1:500），室溫輕搖1h，用TBST洗膜3次，然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG（1:5000），于室溫下孵育1h后，用TBST洗膜3次，最后加入化學(xué)發(fā)光底物1ml，室溫下作用5min，將膜放到曝光盒內(nèi)，在暗室中取出感光膠片加蓋在膜上，壓蓋曝光10s后沖洗膠片。另檢測內(nèi)參蛋白GADPH表達(dá)，方法同前，其中的一抗為兔抗GADPH多克隆抗體。

四、細(xì)胞增殖檢測 取SMMC7721細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中，分別轉(zhuǎn)染Flag-ORF1表達(dá)載體和相應(yīng)空載體，采用MTT法對活細(xì)胞計(jì)數(shù)，以平均值繪制生長曲線。

五、腫瘤細(xì)胞軟瓊脂成集落實(shí)驗(yàn) 取SMMC7721細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染表達(dá)載體和相應(yīng)空載體。預(yù)先配置1.2%和0.7%的瓊脂溶液，滅菌。預(yù)先用1.2%瓊脂鋪平皿，待其凝固，備用。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的SMMC7721細(xì)胞，24h后用配置20%血清的兩倍DMEM重懸細(xì)胞，取細(xì)胞（1×104個）懸液，與0.7%瓊脂溶液等體積混合，加于上層。培養(yǎng)17～20日，觀察、計(jì)數(shù)。

六、Luciferase報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性測定 利用熒光素酶和β-半乳糖苷酶活性測定方法檢測p21、p15和p53報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性。取SMMC7721細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染表達(dá)載體和相應(yīng)空載體，同時轉(zhuǎn)染各種報(bào)告基因以及表達(dá)β-半乳糖苷酶質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24h后，收集并震蕩裂解細(xì)胞，離心收集上清，分別測熒光素酶活性及β-半乳糖苷酶活性，間接評價各種報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、L1 Flag-ORF-1p能夠在SMMC7721細(xì)胞中表達(dá) 肝癌細(xì)胞SMMC7721轉(zhuǎn)染Flag-L1ORF1后，應(yīng)用Western blot法檢測各組細(xì)胞ORF-1p的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag-L1ORF1轉(zhuǎn)染細(xì)胞ORF-1p的表達(dá)明顯高于對照組（P＜0.05，圖 1）。

二、ORF-1p能夠促進(jìn)肝癌SMMC7721細(xì)胞的生長 在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)ORF1p后，細(xì)胞增殖能力明顯強(qiáng)于對照組（P＜0.05，圖 2），說明 ORF1p 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。

三、ORF-1p能夠促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞的錨定非依賴性生長（anchorage-independent growth） 錨定不依賴性生長是腫瘤細(xì)胞的特性之一，也是其發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提。將SMMC7721細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag-L1ORF1表達(dá)載體和相應(yīng)空載體，24h后進(jìn)行軟瓊脂成集落實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞的集落大小和數(shù)量，能反應(yīng)SMMC7721細(xì)胞錨定非依賴性生長能力的改變。結(jié)果顯示：ORF-1p能夠顯著增大SMMC7721細(xì)胞集落的數(shù)量和面積（P＜0.05，圖 3）。

四、L1 ORF-1p能夠影響細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá) 我們選擇與肝癌細(xì)胞生長密切相關(guān)的p21、p15和p53基因，對其轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行檢測，以對應(yīng)孔熒光素酶活性與β-半乳糖苷酶活性比值作為其轉(zhuǎn)錄活性的相對水平。其中，β-半乳糖苷酶起著校正細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞過表達(dá)ORF1p后，p53、p15和p21等報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性均有不同程度的降低（P＜0.05，圖 4），可能系 ORF1-1p 抑制了它們的表達(dá)。

討論

隨著功能基因組研究的深入，過去曾被稱作“垃圾DNA”的反轉(zhuǎn)座子L1由于與腫瘤形成、進(jìn)展密切相關(guān)而逐漸受到關(guān)注。在其編碼的兩個蛋白ORF-1p和ORF-2p中，ORF2p已被證實(shí)與L1反轉(zhuǎn)座過程密切相關(guān)，而ORF-1p大小僅40kDa，表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ORF2p，與其它任何蛋白缺乏序列相似性，其功能尚不十分清楚。

為研究ORF-1p在腫瘤細(xì)胞中的具體作用，我們曾利用RNAi干擾技術(shù)降低肺癌細(xì)胞A549 ORF1p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞生長減慢，成瘤能力明顯減弱[9]。由此我們推測，L1 ORF-1p具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的能力。為明確L1 ORF-1p是否與肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在本研究中，我們設(shè)計(jì)構(gòu)建了L1 ORF-1p相關(guān)表達(dá)載體并進(jìn)行了相關(guān)研究。我們將構(gòu)建好的pCDNA3.0-Flag-ORF1真核表達(dá)載體在肝癌細(xì)胞系SMMC7721中表達(dá)，經(jīng)檢測表明，在實(shí)驗(yàn)組ORF1p的表達(dá)明顯高于對照組，證實(shí)L1 Flag-ORF-1p能夠在SMMC7721細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步檢測顯示在SMMC7721細(xì)胞，過表達(dá)ORF-1p能使細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)；同時軟瓊脂錨定的克隆形成試驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的集落形成能力明顯增加，表現(xiàn)為集落形成數(shù)目增加，集落體積增大。由上述實(shí)驗(yàn)可以看出，ORF-1p能促進(jìn)細(xì)胞增殖和錨定生長。

野生型p53（wtp53）蛋白能夠調(diào)節(jié)p21和p15等多個基因的表達(dá)，從而控制細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化，阻止癌變過程。在細(xì)胞受損后p53通過停止細(xì)胞分裂或者觸發(fā)分子信號級聯(lián)反應(yīng)造成細(xì)胞凋亡來保護(hù)機(jī)體。p21屬于CKIs中的Cip/Kip家族成員，能與CDK結(jié)合而抑制CDK的活性[10]。有報(bào)道p21可以抑制SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，對抗凋亡的發(fā)生，并參與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。p15是CDK4的負(fù)調(diào)控因子，能特異性地抑制細(xì)胞周期依賴激酶CDK4/CDK6活性，抑制Rb蛋白磷酸化，從而抑制細(xì)胞的增殖，同時P15也是TGF-β介導(dǎo)的誘導(dǎo)分化和生長抑制的效應(yīng)因子，p15基因失活可導(dǎo)致細(xì)胞逃避TGF-β介導(dǎo)的生長抑制作用[11]。因此，p53、p15和p21基因的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)，上述癌基因的表達(dá)失活將使細(xì)胞失去正常的生長調(diào)控，促進(jìn)腫瘤形成和進(jìn)展。因此，我們利用Luciferase報(bào)告基因活性測定法進(jìn)一步檢測在L1 ORF-1p過表達(dá)的SMMC-7721細(xì)胞中p53、p15和p21報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果顯示L1 ORF-1p的表達(dá)能夠明顯降低p53、p15和p21報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制相關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)，影響下游調(diào)控作用的發(fā)揮。由此我們推測：ORF-1p有可能在細(xì)胞中通過影響p21、p53和p15等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤侵襲。

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