劉衛(wèi) 朱斌

肝臟是人體重要的消化器官，具有強大的物質(zhì)代謝、合成、生物轉(zhuǎn)化等功能。各種原因?qū)е碌慕K末期肝病患者內(nèi)科治療療效欠佳，病情常不能逆轉(zhuǎn)，病死率高。晚期肝病的治療已經(jīng)成為整個世界范圍內(nèi)的醫(yī)學難題，現(xiàn)在治療終末期肝病最有效的手段是肝移植。但肝移植費用昂貴，加之供肝來源緊張，于是人們把更多的注意力轉(zhuǎn)到了再生醫(yī)學上，即通過干細胞移植治療，以求恢復肝臟的物質(zhì)代謝功能。經(jīng)過多年對干細胞的研究，骨髓干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）移植已經(jīng)在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。近年來對自體骨髓干細胞移植治療肝硬化的研究也逐漸深入。經(jīng)過動物模型及臨床研究，已經(jīng)證實其治療的有效性，并且此方法還具有操作簡單、創(chuàng)傷小、不存在排斥反應(yīng)、并發(fā)癥少、費用低等優(yōu)點。本文就自體骨髓干細胞移植治療肝硬化的研究進展作一綜述。

一、干細胞的生物學特性

干細胞是指未經(jīng)分化的、具有自我更新能力及能分化為多種細胞系的潛能細胞，分為胚胎干細胞和成體干細胞，在成體的組織和器官中存在多種干細胞：如BMSC、肝干細胞、脂肪源性干細胞、外周血干細胞等。BMSC最早由Friedenstein等于1966年發(fā)現(xiàn)。此后，不同的研究小組對骨髓來源的并與BMSCs相似的干細胞進行了一系列的研究，并賦予其不同的稱謂：如骨髓間質(zhì)狀干細胞（bone marrow stromal stem cell，BMSSC）、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）、成人骨髓多分化誘導細胞（marrow-isolated adult multipotent inducible cells，MIAMI）、成人多分化祖細胞（multipotent adult progenitor cells，MAPC）、成人間充質(zhì)干細胞（mesenchymal adult stem cells，MASCS）等[1～3]。這些研究均證實了MSCs類細胞具備多向分化潛能。雖MSCs不能無限增殖，但在良好的培養(yǎng)環(huán)境下可擴增許多倍后仍能保持增殖能力及具有多向分化潛能。MSCs能分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、心肌細胞、成纖維細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞、非中胚層的胰島細胞和肝細胞等[4，5]。

二、干細胞與肝臟

1999年，Petersen等[6]報道了肝細胞具有骨髓源性。骨髓干細胞分為造血干細胞（hemopoietic stem cells，HSCs）和MSCs。一些學者提出骨髓間充質(zhì)干細胞是最有效的肝細胞分化來源細胞[7]。BMSCs向某種細胞系分化取決于培養(yǎng)環(huán)境，尤其依賴于生長因子的誘導。一些化學藥物亦能影響B(tài)MSCs的分化方向，如將BMSCs與地塞米松、胰島素、異丁基黃嘌呤及吲哚美辛等混合培養(yǎng)后，能向脂肪細胞分化。BMSCs向肝細胞分化亦是一個較為復雜的過程。Sarah等[8]對健康成人獲取的MSCs進行培養(yǎng)，加入20ng/mL的EGF、10ng/mL的FGF、20ng/mL的肝細胞生長因子（HGF）、20ng/mL的綿羊頜下黏液蛋白、地塞米松、煙酰胺及苯磺酸等物質(zhì)后，同樣能獲得成熟的肝細胞，且分化而來的肝細胞具備完整的功能。有關(guān)研究證實，在肝臟的微環(huán)境中，干細胞能夠分化為有功能的肝細胞并增殖。Petersen等[6]通過動物實驗證實了小鼠骨髓干細胞可以分化為肝細胞和膽管細胞。Okumoto等[9]用含有細胞外基質(zhì)并加入高濃度的HGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs分化為肝細胞系并增殖，并能表達白蛋白。以上研究表明，干細胞具有分化為成熟肝細胞的潛能，在適宜的微環(huán)境中，干細胞能被誘導分化為肝細胞，并表達成熟肝細胞的特異性因子。

研究表明，骨髓干細胞不僅能通過再生肝細胞來部分恢復肝細胞代謝功能，還能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP），特別是 MMP-9，降解肝臟間質(zhì)纖維組織來改善肝臟纖維化和肝硬化[10，11]。陳國忠等[12]發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞與肝星狀細胞共培養(yǎng)能抑制星狀細胞增值及促進其凋亡。

三、骨髓干細胞的提取和分離

骨髓干細胞的分離是臨床治療的第一步。獲取高質(zhì)量的供體細胞是關(guān)鍵，有時甚至直接影響治療效果。

骨髓干細胞分離方法較多，常用的干細胞分離方法有：貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分離法等。臨床上較為常用的是Oh SH[13]及Wollert[14]等報道的密度梯度離心法。該法較為簡便，實用性強，適合臨床使用：在層流無菌治療室內(nèi)，選患者雙側(cè)髂后上棘為采髓點，常規(guī)消毒鋪巾局麻后，18號骨髓穿刺針穿刺，抽取骨髓 65～95ml左右，以4000U肝素抗凝，避免污染。離心去除脂肪層，用等量DMEM培養(yǎng)液稀釋骨髓，制成細胞懸液。輕輕加到密度1.073/ml的Percoll分離液上，室溫下以1200rpm離心25min。吸取界面細胞層，用生理鹽水洗脫，1500rpm離心5min×3次。生理鹽水重懸細胞，鏡下計數(shù)。

四、治療

目前，臨床常用的有同種異體骨髓干細胞移植及自體骨髓干細胞移植，但同種異體骨髓干細胞移植面臨著缺乏供體細胞、移植細胞被排斥等問題，而自體骨髓干細胞移植則很好地解決了這些矛盾。

骨髓干細胞肝臟移植的方法包括：經(jīng)門靜脈移植、經(jīng)股動脈移植、脾內(nèi)移植、外周靜脈移植、肝內(nèi)移植、腹腔移植等。門靜脈移植：分為經(jīng)皮肝內(nèi)門靜脈移植和剖腹腸系膜靜脈或借助腹腔鏡門靜脈移植兩種方式。后一種方式創(chuàng)傷較大，較少應(yīng)用。經(jīng)皮肝內(nèi)門靜脈移植方法的技術(shù)成熟，且創(chuàng)傷相對較小。通過門靜脈移植BMSCs的方法符合肝臟組織學及生理學特點，細胞更易進入肝竇中[15]。經(jīng)股動脈介入移植：在X線監(jiān)視下，經(jīng)股動脈穿刺，將分離的骨髓干細胞通過導管從肝動脈緩慢注入到病肝內(nèi)，之后用10 mL生理鹽水沖洗管腔，注射速度為1 mL/min[16～18]。由于介入治療的廣泛開展，對其技術(shù)掌握也很熟練，此方法在骨髓干細胞移植中應(yīng)用較多。腹腔移植：此方法創(chuàng)傷較小，且可移植較大數(shù)量的干細胞，但其缺點是干細胞在腹腔內(nèi)較難存活。Liu等[19]用生物包裹的BMSCs移植到90%肝臟被切除的同種異體小鼠腹腔，小鼠的肝功能改善，生存率明顯提高。外周靜脈移植：Terai等[14]對9例肝硬化患者通過外周靜脈將5.20±0.63×109單個核細胞注入體內(nèi)，細胞的存活率超過了90%，術(shù)后肝功能改善明顯。脾內(nèi)移植：將干細胞注入脾內(nèi)，干細胞從脾臟通過門靜脈緩慢進入肝實質(zhì)，可以避免從門靜脈直接注射引起栓塞的可能。Ju等[20]將大約6×106個骨髓間充質(zhì)干細胞注入肝硬化小鼠脾內(nèi)，3小時后在小鼠肝內(nèi)檢測到骨髓干細胞。

姚鵬等[16]對20例慢性肝衰竭患者進行自體骨髓干細胞移植治療，未發(fā)現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，術(shù)后有輕度惡心1例，發(fā)熱1例；在移植8周后，患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、直接膽紅素均逐漸降低，白蛋白逐漸升高，凝血酶原活動度逐漸上升；張強[21]等的研究表明，移植后大多數(shù)患者癥狀明顯改善，腹水減少，食欲改善，體力好轉(zhuǎn)，睡眠改善。其中3例肝硬化Child-Pugh C級患者取得了較好的療效，提示肝臟損害嚴重的肝硬化患者肝內(nèi)移植骨髓干細胞仍然可以獲得較好的效果。Khan等[22]選擇4例肝硬化患者，在自體骨髓干細胞移植治療術(shù)后6個月的隨訪中，3例患者血清白蛋白升高、1例無變化。Terai等[17]報道在9例肝硬化患者，采用自體骨髓干細胞外周靜脈注射到患者體內(nèi)，術(shù)后第一天9例患者均出現(xiàn)發(fā)熱（約38℃），無其他副反應(yīng)。移植24周后觀察發(fā)現(xiàn)所有患者血清白蛋白、總蛋白及Child-Pugh評分均有顯著提高。Levicar等選擇5例慢性肝病患者，通過門靜脈（3例）及肝動脈（2例）將自體骨髓干細胞移植到肝臟內(nèi)，移植細胞數(shù)量為1×106至2×108之間，連續(xù)隨訪12～18個月顯示所有接受細胞移植的患者均較好的耐受了移植治療，其中4例患者白蛋白增加并一直保持不變，所有患者甲胎蛋白均保持在正常范圍內(nèi)，未見肝臟腫瘤及局部肝損害發(fā)生，未見嚴重的并發(fā)癥和副反應(yīng)發(fā)生[23]。最近，郭曉鐘等報道，對78例肝硬化患者行自體骨髓干細胞移植治療，在移植4周后，患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶明顯降低，白蛋白、PTA明顯上升、Child-Pugh評分顯著提高，腹水明顯減少或消失，乏力納差改善[24]。

通過目前的臨床觀察，干細胞移植治療肝硬化已經(jīng)表現(xiàn)出了明顯的治療效果，肝功能得到改善，減少了患者的痛苦，改善了生活質(zhì)量，提高了生存率，并且未出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥和副反應(yīng)。

五、自體骨髓干細胞移植治療肝硬化的相關(guān)問題

在各種病理條件的微環(huán)境下，干細胞向各種組織細胞分化的機制還不清楚，在移植干細胞后，會不會引起腫瘤細胞的分化和增殖，還需要通過長期的實驗和臨床來證實。目前，自體骨髓干細胞移植治療肝硬化開展的時間才三年多，患者的遠期療效及是否有其他并發(fā)癥還有待觀察。對于干細胞移植治療的適應(yīng)證、禁忌證、移植途徑的選擇、移植干細胞的數(shù)量、移植次數(shù)等還沒有相關(guān)的標準，還需要不斷的完善和規(guī)范。

六、展望

二十一世紀將會是細胞治療的時代，干細胞移植治療肝硬化的諸多優(yōu)點，使得它非常適合我國的國情。我國的干細胞臨床治療起步早，開展范圍廣，有較好的臨床經(jīng)驗，取得了較好的效果，為我們的干細胞研究奠定了一個非常好的基礎(chǔ)。同時，干細胞移植也為我們在某些重癥疾病的治療上帶來了希望，是我們以后基礎(chǔ)研究和臨床治療發(fā)展最前沿的方向。

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