鄧豫 王桂華 金源 李小蘭 陶德定 李維娜 龔建平 胡俊波

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide-3 kinase,PI3K）是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要蛋白，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化及糖代謝等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[1]。PI3K活性與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2，3]。p55PIK是IA型PI3K的調(diào)節(jié)亞基之一。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了能夠高表達(dá)其氨基端的24個(gè)氨基酸的腺病毒表達(dá)載體（Ad-N24）[4～6]，并證明其能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖[7]。由于病毒類載體的生物安全性問(wèn)題影響了其應(yīng)用，我們又合成了TAT-N24 穿膜融合多肽（簡(jiǎn)稱 TAT-N24）[8，10]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肝癌HepG2細(xì)胞周期、DNA合成能力及AKT磷酸化狀態(tài)，初步探討了TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)安全、有效的腫瘤分子靶向治療藥物提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞、試劑與儀器 HepG2細(xì)胞株由本室傳代培養(yǎng)；高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Hyclone公司，小鼠抗人BrdU單抗購(gòu)于Santa Cruz公司，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自丹麥Dako公司，F(xiàn)ACSort流式細(xì)胞儀由美國(guó)Becton Dickson公司生產(chǎn)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)與處理 HepG2細(xì)胞用含10%小牛血清和抗生素（青霉素100U/ml及鏈霉素100μg/ml）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融匯度為70%時(shí)加入TAT-N24多肽和對(duì)照多肽（終濃度為100μg/ml）處理24小時(shí)。

三、BrdU/PI雙摻法測(cè)定細(xì)胞DNA合成 HepG2細(xì)胞經(jīng)TAT-N24多肽和對(duì)照多肽處理24小時(shí)后，加入 BrdU（終濃度為 10μmol/L），30min后用 0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS洗1遍，用75%冰乙醇固定，-20℃保存過(guò)夜。取固定后的細(xì)胞，PBS洗1遍，PBS-T（含0.1%BSA，0.2%Tween-20）洗1遍，2 mol/L鹽酸作用 45min，以 0.1mol/L四氫硼砂（pH=8.0）洗 1遍，PBS-T（含 0.1%BSA，0.2%Tween-20）洗 1 遍，加鼠抗人BrdU一抗（1:100），37℃孵育2h，PBS洗3遍后再加FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1:20），室溫孵育1h，PBS洗 3 遍，加入碘化丙啶（Propidium iodide，PI，終濃度為 4μM）和 RNAase（終濃度為 2μg/ml），室溫孵育15min，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

四、Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) HepG2細(xì)胞用TAT-N24多肽和對(duì)照多肽處理24h后，用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗2遍后，用適量RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30min，12000rpm4℃離心10min，取上清，加等體積2×SDS上樣緩沖液，混勻后置于100℃水浴5min。蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜（350mA，90min），5%脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后孵育一抗（兔抗人GAPDH、總AKT及磷酸化AKT抗體），4℃過(guò)夜。次日用TBST洗3遍，然后加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育，室溫孵育2h后，TBST洗3遍，每次15min，最后用ECL顯色液顯影。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、TAT-N24對(duì)HepG2 DNA合成的影響 空白組R2為42.7%±3.6%，對(duì)照組R2為38.2%±2.8%，而TAT-N24組R2為25.3%±2.7%，提示TAT-N24能有效抑制HepG2細(xì)胞DNA合成（圖1）。

圖1 TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞DNA合成的影響

二、TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 上述細(xì)胞經(jīng)BrdU染色后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果顯示，空白組、對(duì)照組和TAT-N24組G0/G1期細(xì)胞比例分別為52.6%±4.7%、52.0%±4.6%和 68.6%±4.7%（圖 2，均 P＜0.05），提示 TAT-N24 能有效阻滯HepG2細(xì)胞周期進(jìn)程。

圖2 TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

三、TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞AKT磷酸化的影響 細(xì)胞經(jīng)處理后，收集細(xì)胞，提取蛋白并定量后進(jìn)行Western blot檢測(cè)，觀察TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞AKT磷酸化的影響。應(yīng)用NIH Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果提示TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞AKT磷酸化水平無(wú)明顯影響（圖3）。

圖3 TAT-N24對(duì)HepG2細(xì)胞AKT磷酸化的影響

討論

P55PIK是PI3K的調(diào)節(jié)亞基之一，與其它調(diào)節(jié)亞基一樣具有較為保守的結(jié)構(gòu)域，其氨基端（N端）的24個(gè)氨基酸是其區(qū)別于其它亞基的最重要的特征。在我們前期的研究中證實(shí)，利用質(zhì)粒載體在細(xì)胞內(nèi)外源性表達(dá)N24能夠有效地抑制多種人類腫瘤細(xì)胞的增殖[11～14]。研究證實(shí)，利用腺病毒載體在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)這24個(gè)氨基酸能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]，驗(yàn)證了針對(duì)P55PIK的腫瘤分子靶向治療的可行性?？紤]到病毒載體作為治療手段存在生物安全性等不利因素，我們合成并純化了TAT-N24穿膜融合多肽，該多肽能否同樣抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)是我們主要討論的問(wèn)題。

本研究顯示，TAT-N24能有效抑制HepG2細(xì)胞DNA合成，并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程于G0/G1期，與腺病毒N24對(duì)HepG2細(xì)胞的作用類似。其可能的機(jī)制為：N24通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Rb蛋白，降低了p55PIK對(duì)Rb的磷酸化作用，進(jìn)而影響Rb對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，同時(shí)DNA合成受到顯著抑制。此外，結(jié)果表明TAT-N24不影響細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化水平，提示TAT-N24未影響PI3K常規(guī)通路下游AKT的磷酸化水平，副反應(yīng)可能較其它PI3K抑制劑小，這一點(diǎn)有待在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。TAT-N24是一種有前景的特異性抑制PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子靶向藥物。

本研究在體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)TAT-N24具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，與腺病毒N24作用類似，這些結(jié)果需在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)其有效性、副反應(yīng)及其生物安全性。

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