丁 鴻，邱東萍，游柏壽

（1.揭陽職業(yè)技術學院，廣東 揭陽 522000；2.彭澤縣人民醫(yī)院，江西 彭澤 332700）

潮陽草雞是潮汕地區(qū)的一種優(yōu)良雞種，善覓食，抗病力強，成活率高。屬瘦肉型，皮薄肉嫩，味道鮮美，香脆滑潤，適宜白切、清燉、鹽焗等，是傳統(tǒng)的宴客佳肴。本實驗以潮陽草雞胚胎組織為材料，進行體外成纖維細胞的培養(yǎng)，旨在為潮陽草雞的育種提供細胞學方面的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 潮陽草雞孵化蛋30枚，9～13日齡，購自汕頭市白沙禽畜原種研究所種雞場。

1.1.2 供試試劑 MEM(含Earle′s鹽)培養(yǎng)基購自Gibco，胰蛋白酶（Trypsin 1：250）購自 Amresco，標準胎牛血清（Standard FBS）購自Hyclone，臺盼藍購自Sigma，青霉素、鏈霉素為國產。全培養(yǎng)基：MEM基礎培養(yǎng)基+10%標準胎牛血清+100 IU/mL雙抗。

1.2 方 法[1-3]

1.2.1 原代培養(yǎng) 超凈工作臺內取雞胚腿部肌肉組織置于小培養(yǎng)皿內，用1×PBS+1%雙抗漂洗4～5次，用眼科剪剪成1mm3左右大小，移入培養(yǎng)瓶壁，均勻分散，加入全培養(yǎng)液，倒置培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱中（37.5℃，5%CO2），過夜。當組織塊貼壁牢固時，翻轉培養(yǎng)瓶，不浸潤組織塊。當細胞長出后，及時更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 當培養(yǎng)細胞生長至80%～90%匯合時，可進行傳代培養(yǎng)。去舊培養(yǎng)液，加入預熱至37℃，0.75%的 NaCl溶液，清洗細胞 2～3次，然后加入0.25%的胰酶液，消化10～30 s，倒置顯微鏡下觀察。當發(fā)現細胞胞質回縮，細胞間隙增大時，立即加入全培養(yǎng)液，細胞懸液計數，按1∶2或1∶3的比例分瓶，放入溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細胞冷凍保存 將處于生長對數期的細胞于24 h前更換新鮮全培養(yǎng)基。常規(guī)方法消化細胞，制備成單細胞懸液，血球計數板計數。1 000 r/min離心8min，收集細胞。視細胞數量多少加入凍存液（10%DMSO+90%FBS），調細胞密度到（3～5）×106mL，分裝入無菌塑料凍存管中，每支1 mL。將凍存管裝入裝有異丙醇的冷凍盒，-70℃冰箱過夜。次日提出安瓿，放入液氮罐中保存。

1.2.4 冷凍細胞復蘇 從液氮罐中小心取出凍存管，迅速浸沒在37～40℃的溫水中并快速晃動，使細胞液在1～2min內完全融解。吸出細胞懸液，加入到裝有全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。置于37.5℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細胞形態(tài)學性狀檢測

1.3.1 細胞一般形態(tài)學觀察 在培養(yǎng)過程中，每天觀察細胞生長狀態(tài)、培養(yǎng)液的pH值改變以及細胞是否污染等。并作好記錄，用相差顯微鏡拍照。

1.3.2 制作細胞生長曲線[4]取生長狀態(tài)良好細胞，常規(guī)方法消化制成細胞懸液，按（1～5）×105個/mL的細胞密度在24孔培養(yǎng)板中接種等量細胞。共設7組，每組3孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從次日起，即開始計算第一組每孔中的細胞數，取3孔的平均值，如此至第7組結束。用Origin 6.1軟件繪成細胞生長曲線圖。

1.3.3 細胞凍存前及復蘇后細胞存活率 細胞冷凍前和細胞復蘇后，采用臺盼藍染色法計算細胞存活率。在Trypan染液中，健康活細胞胞體完整，細胞透明不著色，呈藍色者均為死細胞。計數1 000個細胞，計算細胞存活率。

2 結果與分析

2.1 胚胎成纖維細胞生長狀態(tài)

如圖1、圖2所示，組織塊貼附1～2 d后便可見細胞從組織塊周圍游出生長，典型的成纖維樣，隨后迅速向外擴散，呈明顯的火焰狀或放射狀走形。2～3 d后便可鋪滿瓶底，消化傳代。消化傳代后，細胞30 min便開始部分貼壁。2～3 d便可長滿瓶底，此時細胞多發(fā)生粘連生長，呈網狀分布，細胞界線不甚清晰。長滿后繼續(xù)消化傳代，如此直到冷凍保存。

圖1 潮陽草雞原代細胞

圖2 潮陽草雞傳代細胞

2.2 細胞生長曲線

常規(guī)方法制備細胞懸液，計數，接種24孔培養(yǎng)板，每孔1mL細胞懸液，2.0×105個細胞。連續(xù)7 d測得數據如表1所示。

表1 潮陽草雞細胞培養(yǎng)7 d細胞平均數表

繪制細胞生長曲線圖，由圖3可以看出，細胞生長曲線呈“S”型，主要經歷潛伏生長期、指數生長期、水平靜止期3個時期。細胞的群體倍增時間約為24 h。在培養(yǎng)后期，細胞產生接觸抑制和密度抑制，生長緩慢或停止生長。

圖3 潮陽草雞細胞生長曲線

2.3 細胞凍存前及復蘇后細胞活率

潮陽草雞胚胎成纖維細胞在凍存前和凍存后的平均存活率分別達到94.8%和90.2%，表明細胞在生長時健康狀況良好，培養(yǎng)條件適宜；凍存后解凍則存活率有所下降，表明細胞在冷凍和復蘇時可能受到一定的損傷。但在復蘇后培養(yǎng)30～60min內便可見有細胞貼壁，4～6 h完全貼壁，與細胞傳代后貼壁相比，復蘇后細胞貼壁鋪展時間明顯延長，可達24～36 h，48 h后細胞基本長滿瓶底，可傳代培養(yǎng)，傳代后細胞生長速度和凍存前基本一致。

3 小結與討論

本實驗以潮汕地區(qū)地方優(yōu)質雞種——潮陽草雞胚胎為材料，在體外成功培養(yǎng)了成纖維細胞，并進行了傳代和冷凍保存，復蘇后細胞的存活率仍達到90%以上，為潮陽草雞的育種在細胞學方面提供了一定的科學依據，也為學院的細胞培養(yǎng)工作搭建了技術平臺。

細胞培養(yǎng)的最大危險是發(fā)生培養(yǎng)物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染[5-7]，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導致培養(yǎng)失敗，故細胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)都應嚴格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染[8]。

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