張超凡，黃艷嵐，周 虹，易九紅

（湖南省作物研究所，湖南 長沙 410125）

簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR），又稱微衛(wèi)星DNA和短串聯(lián)重復，可依據(jù)微衛(wèi)星序列兩端互補序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴增微衛(wèi)星片段，將擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，再根據(jù)分離片段的大小決定基因型并計算等位基因頻率。SSR標記缺點是引物開發(fā)難度大，但由于是共顯性標記，具有用量少，數(shù)量豐富、重復性好等優(yōu)點[1]。目前，SSR 標記已廣泛應(yīng)用于水稻[2-4]、小麥[5-6]、玉米[7]、大豆[8]、油菜[9-10]等的遺傳多樣性分析和圖譜構(gòu)建。本研究利用SSR分子標記對來自湖南31份甘薯品種進行遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系鑒定，目的在于探討湖南甘薯地方品種與育成品種之間的遺傳多樣性，為進一步分析湖南甘薯遺傳多樣性提供可靠的標記手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 本研究所用甘薯材料取自湖南省作物研究所，包括11份育成品種和20份地方品種（表1），均來自于湖南省。

1.1.2 試 劑 SSR引物如表2所示，由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成。Taq DNA聚合酶（2.5 U/mL）和DNA Marker購自天根生化有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組的提取 DNA取頂部展開新鮮葉片3～4片，置已編號保鮮袋中，采用CTAB[11]法對甘薯幼嫩葉片進行基因組DNA提取。

1.2.2 SSR分析 SSR的PCR擴增體系：2μL的10×PCR Buffer，2.5 μL 的 2.0 mM dNTPs，50 ng 甘薯DNA，1U Taq酶，2μL的5 mM引物（對），加ddH2O至20μL。SSR擴增條件為：94℃預變性4min；然后進行以下35個循環(huán)：94℃變性30 s，58℃復性30s，72℃延伸1min，最后72℃充分延伸7min。PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA pH 8.0，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯腈）變性后自然冷卻，用5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色，并拍照保存。

表1 本研究所用的品種名稱

1.2.3 統(tǒng)計方法 膠板晾干后在燈箱上讀帶。統(tǒng)計方法參照文獻[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標記的多態(tài)性分析

對SSR分子標記分析的12對SSR引物進行PCR擴增，引物對SSR11電泳結(jié)果如圖1所示，共檢測出74等位基因位點，每對引物檢測出的等位基因位點3～10個，平均為6個。其中引物SSR7擴增的等位基因位點最多，為10個，引物SSR12擴增的等位基因位點最少，為3個。

表2 SSR引物組合及擴增條帶

圖1 SSR引物組合SSR11對31個甘薯品種的擴增結(jié)果

2.2 甘薯品種間的遺傳差異

用SSR標記對31份甘薯品種進行了聚類分析，供試材料的遺傳距離為0.272 7～0.626 9，平均0.520 4，表明供試材料之間遺傳多樣性豐富，遺傳差異大。根據(jù)甘薯SSR標記分析，對供試材料進行UPGMA聚類分析（圖2）。從聚類圖可以看出，湘78-150與湘薯12號的遺傳距離最近。

圖2 基于SSR標記得到的31份甘薯品種的聚類圖

2.3 甘薯地方品種與育成品種遺傳差異分析

經(jīng)過遺傳距離計算，20份湖南地方品種遺傳距離為 0.288 1～0.814 8，平均 0.524 0；11 份育成品種遺傳距離為0.272 7～0.894 7，平均0.511 5。兩類材料平均遺傳距離大小為GDMC>GDL。湖南甘薯地方品種與湖南育成品種的遺傳距離0.288 1～0.7037，平均 0.516 7。

3 討論

分子標記技術(shù)可以不受環(huán)境、發(fā)育時期、不同器官等的限制，從基因組水平上揭示遺傳變異程度。利用SSR標記進行研究時，需要知道研究材料兩端的序列信息，開發(fā)有一定困難，費用也較高，使得其在甘薯遺傳多樣性研究中受到限制。研究利用SSR方法分析31份湖南甘薯地方品種與育成品種的遺傳多樣性，擴增的等位基因位點豐富。聚類圖上可以看出湘薯10號與湘薯6號的親緣關(guān)系較近；湘薯17號與湘薯86-75親緣關(guān)系較近，這與它們的系譜圖相吻合，說明SSR標記適用于檢測甘薯的遺傳多樣性。

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