張 楠，謝 放

（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

目前選育高品質(zhì)植物品種主要采用的是分子標(biāo)記輔助育種方法，因而怎樣獲得高質(zhì)量的基因組DNA用于后續(xù)的分子標(biāo)記將顯得非常關(guān)鍵。番茄中含有較多的多糖和其他次生代謝產(chǎn)物（酚、酯、萜、色素等）[1]，這給高質(zhì)量的DNA提取帶來(lái)較多的困難。尤其是多糖、色素、蛋白質(zhì)成分是影響DNA純度最常見的問(wèn)題。如何做到在去除污染物又能相對(duì)保持高的產(chǎn)量的同時(shí)，對(duì)大批量的模板進(jìn)行提取，一直是像番茄這類含多糖、色素和鹽類物質(zhì)較多的植物所探討的問(wèn)題。

在加工番茄分子標(biāo)記輔助育種時(shí)，多采用CTAB法[2]、SDS法及DNA試劑盒[3-4]等提取番茄DNA，效果均不太理想。通過(guò)試驗(yàn)比較多種提取方法，得到一種適用于提取大批量加工番茄DNA的方法——改進(jìn)CTAB法。通過(guò)此法克服了番茄中富含多糖、蛋白質(zhì)、酚和色素的影響，所得DNA通過(guò)凝膠電泳和分子標(biāo)記均獲得了滿意的結(jié)果，可以將此方法在富含上述物質(zhì)的植物中推廣使用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

加工番茄葉片于2010年7月采摘于蘭州交通大學(xué)科技園試驗(yàn)田。將采摘的幼嫩葉片和老葉片分別裝入塑料袋置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藥品與試劑

引物序列：隨機(jī)引物S636（GGGATATCGC），ISSR 引物 855（ACACACACACACACACYT）上述引物由上海生工生物工程公司合成。

CTAB 提取液：含 2%CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.2%β-巰基乙醇，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL pH 值 8.0，PVP，10 mg/mL RNase；TE 緩沖液：含 10 mmol/L Tris-HC1，l mmol/L EDTA（pH 8.0）；飽和酚∶氯仿∶異戊醇（V∶V∶V）=25∶24∶1，氯仿︰異戊醇（V∶V）=24∶1；50×TAE 緩沖液：1 L 緩沖液中含有242.0 g Tris堿，57.1 mL冰乙酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，pH 值 8.0。

1.3 儀器

TGL-20M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）；紫外分析儀（北京六一儀器廠）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR擴(kuò)增儀（Biometra）；HH-2恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；UVP凝膠成像系統(tǒng)（USA）。

1.4 DNA的提取

（1）取番茄葉片2～3片放入研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉末，稱取約0.2 g粉末，快速裝入5 mL離心管中；（2）加入850 μL預(yù)熱CTAB提取緩沖液，65℃水浴40 min，冷卻至室溫；（3）加入等體積的Tris-飽和酚：氯仿：異戊醇（V25∶V24∶V1）輕震搖勻后，4℃、12 000 g離心 10 min；（4）取上清液，加入10%體積3 mol/L NaAc溶液搖勻后再加入等體積的氯仿-異戊醇（V24∶V1）輕震搖勻后，4℃、12 000 g離心10 min；（5）取上清液，加入2倍體積的冰凍無(wú)水乙醇，冰浴20 min，用無(wú)菌牙簽將絮狀物挑出放入新管；（6）70%乙醇（體積分?jǐn)?shù)）漂洗沉淀兩次，37℃烘干，溶于60 μL TE緩沖溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 DNA的檢測(cè)

從提取的DNA液中吸取10 μL，用TE溶液定容至2 000 μL，在紫外分光光度計(jì)下測(cè)OD260，OD280值，并計(jì)算OD260/OD280，跟據(jù)公式 [DNA濃度（μg/mL）=50×OD260×稀釋倍數(shù)）]計(jì)算 DNA 濃度；稱取0.2 g瓊脂糖加人25 mL的1×TAE緩沖液，經(jīng)微波爐加熱溶解，待其不燙手時(shí)加入0.2 μL EB（10 mg/mL）即用含EB的0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的 DNA，每孔點(diǎn)樣 4 μL（3 μL DNA 樣品+1 μL 上樣緩沖液），電壓80V，電泳40 min。

1.6 PCR擴(kuò)增

采用25 μL擴(kuò)增體系，以隨機(jī)引物S636和ISSR引物855分別作為單引物，隨機(jī)擴(kuò)增體系組成參見楊永超等[5]的方法，ISSR擴(kuò)增體系參見朱為民等[6]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，5 V/cm，1 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA溶液吸光值、濃度及電泳檢測(cè)

當(dāng)OD260/OD280值在1.7～1.9時(shí)說(shuō)明所提取的DNA質(zhì)量較好，比值小于1.7可能有蛋白污染，比值大于2.0，說(shuō)明有RNA污染或DNA已經(jīng)降解。幼嫩葉片和老葉片所提取DNA溶液經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm處的吸光值并計(jì)算OD260/OD280，其值在1.75～1.91之間，計(jì)算得DNA濃度為在40～80 ng/L，并結(jié)合電泳圖譜得出所提DNA純度較高，RNA和蛋白質(zhì)含量較少，無(wú)降解，根據(jù)計(jì)算將DNA濃度調(diào)整為20 ng/μL，于－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 總DNA電泳檢測(cè)

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用RAPD隨機(jī)引物和ISSR引物對(duì)隨機(jī)提取的兩個(gè)老幼葉片的DNA模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增然后進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖2、圖3）。從結(jié)果來(lái)看采用兩種分子標(biāo)記均能擴(kuò)增出清晰、無(wú)拖尾的電泳圖譜，說(shuō)明用此法所提取的加工番茄DNA在結(jié)構(gòu)上具有完整性；加樣口無(wú)亮帶，說(shuō)明所得的DNA溶液較純，無(wú)其他糖類、酚類、色素等雜質(zhì)，適合RAPD和ISSR等分子標(biāo)記試驗(yàn)。

圖2 用RAPD引物對(duì)DNA模板質(zhì)量進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)

圖3 用ISSR引物對(duì)DNA模板質(zhì)量進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)

3 討論

植物組織在生長(zhǎng)中隨著生長(zhǎng)階段的不同所富含的多糖、酚類和色素含量各不相同[1]。本研究通過(guò)提取出番茄幼嫩葉片和老葉片中的DNA經(jīng)紫外、電泳和PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)表明純度高、無(wú)雜質(zhì)存留，DNA片段完整，不需進(jìn)一步純化即可用于分子標(biāo)記試驗(yàn)。本法與以往的提取方法相比，具有以下特點(diǎn)：第一，采用冷藏和液氮研磨的方式最大程度的避免了葉片細(xì)胞中DNA的降解，保證了所提DNA的質(zhì)量和片段的完整性。第二，在提取緩沖液中加入防止酚類氧化與易與酚類結(jié)合的試劑β-巰基乙醇和PVP（聚乙烯吡咯酮），防止了酚類與DNA的結(jié)合。第三，采用tris-飽和酚-氯仿-異戊醇，氯仿-異戊醇相結(jié)合的抽提法更有效地去除了蛋白質(zhì)和酚類的殘留。第四，通過(guò)加入3 mol/L NaAc能明顯溶解脂溶性色素和多糖，隨后經(jīng)冰凍無(wú)水乙醇沉降和70%乙醇多次洗滌能有效達(dá)純化DAN的目的。同時(shí)，應(yīng)用此法也成功提取了西瓜和甜瓜的DNA。此外，可采用老葉片進(jìn)行DNA的提取，本法對(duì)于在植物分子標(biāo)記輔助育種過(guò)程中獲得種子很少的品種，解決了傳統(tǒng)方法通過(guò)黃化苗和幼苗提取DNA所面臨材料短缺的問(wèn)題。

[1] 霍 鋒，張 瀧，張 婭.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物鑒別中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（8）：4089-4091.

[2] 路 盼，康立功，許向陽(yáng)，等.3個(gè)番茄品種及其6份親本材料指紋圖譜的構(gòu)建[J].中國(guó)瓜菜，2010，23（3）：6-10.

[3] 高永利，李景富，王傲雪，等.番茄RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（2）：175-180.

[4] 董坦坦，姬長(zhǎng)英，周 俊，等.成熟番茄的圖像識(shí)別及其位姿的獲取研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（8）：152-155.

[5] 鄧正春，肖清平，覃事玉，等.影響番茄雜交制種產(chǎn)量的因素分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（7）：21-22，25.

[6] 朱為民，王曙霞，楊少軍，等.番茄ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：5-8.