蔣 萍 黃樹紅 陳淑敏 王桂英

（山東省陽信縣人民醫(yī)院，山東 陽信 251800）

慢性阻塞性肺疾病 （COPD）是一種以氣流受限為特征的疾病，研究證實(shí)氣道炎癥尤其是小氣道炎癥是COPD的主要病變和發(fā)病的主要原因，腫瘤壞死因子α （TNF-α）在氣道局部炎癥中起重要作用。但到目前為止，誘發(fā)和控制慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）炎癥的機(jī)制尚未清楚，可能與氣道內(nèi)炎性因子與抗炎介質(zhì)的失衡，或內(nèi)源性抗炎機(jī)制缺陷有關(guān)。氣道局部炎癥機(jī)制的研究方法有多種，誘導(dǎo)痰技術(shù)由于安全可靠等原因，更適合進(jìn)行氣道局部炎癥機(jī)制的研究。為此，我們通過測定COPD急性加重期患者誘導(dǎo)痰液中TNF-α和IL-6的水平，以探討其在COPD急性加重過程中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2009年3月至2010年12月我院呼吸科住院的COPD急性加重期患者共38例，男25例，女13例；年齡50～85歲；病程5～40年。COPD緩解期患者38例，男28例，女10例；年齡55～86歲；病程8～35年。所有病例均符合2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》的標(biāo)準(zhǔn)[1]，并在入選前4周內(nèi)未吸入糖皮質(zhì)激素，3個(gè)月內(nèi)未全身使用糖皮質(zhì)激素治療，X線證實(shí)無肺炎者，近4周內(nèi)沒有用過抗生素和呼吸系統(tǒng)之外的細(xì)菌感染者。健康對(duì)照組28例，入選標(biāo)準(zhǔn)：非吸煙者，無呼吸道癥狀及心肺等疾患，入選前4周內(nèi)無呼吸道感染史。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外合并支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張癥等其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病，除外合并其他全身炎癥性疾病、過敏性疾病、腫瘤性疾病、系統(tǒng)性免疫功能異常等可能引起補(bǔ)體活化的疾病。全部研究對(duì)象均獲得知情同意。

1.2 方法

①樣本采集：開水或生理鹽水徹底漱口、擤鼻涕、清理口腔和鼻腔分泌物，吸入沙丁胺醇200μg，20min后霧化吸人3%無菌高滲氯化鈉溶液20～30min，留痰于無菌干燥盛痰杯中，如受試者在霧化吸人過程中出現(xiàn)喘息、惡心嘔吐、呼吸困難及其他難以忍受的癥狀則隨時(shí)終止試驗(yàn)，并給予沙丁胺醇200μg吸入，觀察至癥狀緩解。②誘導(dǎo)痰的采集、處理和質(zhì)量控制：參照文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行。整個(gè)過程盡量在2h內(nèi)完。取無唾液成份的痰液放人離心試管中，加4倍體積的1 g/L二硫蘇糖醇孵育，螺旋振蕩15min，加入與二硫蘇糖醇等體積的Hank's液，再置于37℃恒溫水浴振蕩箱振蕩15min使其均勻，3500r/min（r=15cm），離心20 min，沉淀細(xì)胞作痰液質(zhì)量檢查，上清液于-80℃凍存待測。沉淀細(xì)胞用Hank'液懸浮，在血細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)染色排除法測定細(xì)胞存活率。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸浮密度至1×106，將75μL懸浮液置于細(xì)胞離心機(jī)450 r/min離心6 min，細(xì)胞沉渣涂片，風(fēng)干，吉姆薩染色，每張涂片計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞。分類計(jì)數(shù)，鱗狀上皮細(xì)胞＜20%，細(xì)胞存活率＞50%提示痰來源于下呼吸道，為合格標(biāo)本，可進(jìn)行有關(guān)生化測定。③測定TNF-α和IL-6：采用ELISA法測定痰上清中TNF-α和IL-6 （美國BD公司生產(chǎn)上海西唐生物科技有限公司提供試劑盒）嚴(yán)格按照試劑說明書操作。④肺功能檢測：所有觀察對(duì)象均使用肺功能儀測定FEV1，F(xiàn)VC，并計(jì)算出第一秒用力呼氣流量占預(yù)計(jì)值百分?jǐn)?shù)（FEV1%pre）和FEV/FVC%等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組間肺功能指標(biāo)比較

急性加重組、穩(wěn)定期組FEV1%p re較健康對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）；急性加重組、穩(wěn)定期組FEV1/FVC%、MMEF%pre較健康對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）；急性加重組、穩(wěn)定期組PEF%pre較健康對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）；急性加重組、穩(wěn)定期組RV%pre較健康對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組間誘導(dǎo)痰上清液中IL-6、TNF-α濃度比較

表1 各組間肺功能指標(biāo)比較

急性加重組、穩(wěn)定期組患者誘導(dǎo)痰上清液中TNF-α、IL-6濃度較健康對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；急性加重組患者誘導(dǎo)痰上清液中

TNF-α、IL-6濃度較穩(wěn)定期組明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組間誘導(dǎo)痰上清液中TNF-α、IL-6濃度比較

2.3 誘導(dǎo)痰上清液中IL-6濃度與肺功能氣流阻塞指標(biāo)FEFV1%pre、

FEV1/FVC%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.689，P＜0.01；r=-0.673，P＜0.01）；

3 討 論

COPD是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。COPD是由多種炎性細(xì)胞及其所釋放的多種炎性遞質(zhì)、細(xì)胞因子參與的復(fù)雜的慢性氣道炎癥。COPD急性發(fā)作時(shí)，病毒或細(xì)菌所含的某些抗原成分或代謝產(chǎn)物如脂多糖、內(nèi)毒素可以激活局部肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-α等炎性因子[3]。這些炎性因子繼而又可促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6、IL-8。由于局部產(chǎn)生的細(xì)胞因子吸收入血以及內(nèi)毒素引起體內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞廣泛的激活，導(dǎo)致血中 TNF-α升高。學(xué)者多次研究發(fā)現(xiàn) COPD 急性發(fā)作期患者血中IL-6、IL-8水平與TNF-α水平呈明顯正相關(guān)。急性感染時(shí)，通過巨噬細(xì)胞激活使TNF-α的產(chǎn)生增多，而TNF-α可促進(jìn)炎癥細(xì)胞粘附游走和浸潤，迅速引起肺組織損傷。表明TNF-α是COPD病情加重的一個(gè)重要指標(biāo)，也是COPD嚴(yán)重程度的重要標(biāo)志。

IL-6是一種主要由活化的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等分泌的具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，因分子結(jié)構(gòu)中保留了2個(gè)半胱氨酸殘基而表現(xiàn)出化學(xué)趨化作用，參與COPD的氣道炎癥和氣道重塑[4]。

TNF-α是具有廣泛生物活性的炎性因子，參與了炎癥過程中中性粒細(xì)胞的聚集和活化，使 COPD患者氣道黏膜中大量的中性粒細(xì)胞浸潤。研究發(fā)現(xiàn)COPD患者誘導(dǎo)痰和血漿中 TNF-α水平均較非 COPD患者明顯增高。目前為止，COPD炎癥機(jī)制尚未明確，可能與炎性因子和抗炎遞質(zhì)的失衡有關(guān)[5]。隨著局部炎癥的好轉(zhuǎn)，患者癥狀改善，病情趨于緩解。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：COPD急性發(fā)作期TNF-α、IL-6表達(dá)水平與FEV1%pre值呈直線負(fù)相關(guān)，提示這些指標(biāo)在炎性反應(yīng)的發(fā)展過程中均發(fā)揮了作用。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2007,30(1):8-17.

[2] 曾勉,劉凌云,張式鴻,等.各期慢性阻塞性肺疾病患者誘導(dǎo)痰細(xì)胞成分與肺功能的關(guān)系[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2007,28(4):422-425.

[3] Hacker T,Holloway,Holqate ST,et al.Dynamics of pro-inf l ammatory and anti-inf l ammatory cytoline release during acute inf l ammation in cllrom c obstructive pulmonary disease: an ex vivo study[J].Respir Res,2008,9(1):472.

[4] DE BOER W I. Cytokines and therapy in COPD[J]. Chest,2002,121(2):209S-218S.

[5] 王卓,夏國光,姚婉貞.慢性阻塞性肺疾病急性加重期病原學(xué)研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2009,12(11):1942.