胡 輝 荊緒斌 蔡先彬 王欽加

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚類色素，其抗腫瘤效應(yīng)近年來(lái)受到研究者關(guān)注,實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素有確切的抗腫瘤活性[1～4]。我們前期研究也證實(shí)了姜黃素有抗食管癌作用，其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)不同濃度姜黃素作用食管癌EC-109細(xì)胞后的細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞周期各時(shí)相分布情況和cyclin D1、cyclin E表達(dá)情況，以初步闡述姜黃素抑制食管癌細(xì)胞增殖的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

姜黃素購(gòu)于成都思科華公司,噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞楓(DMSO)購(gòu)自SIGMA公司，碘化丙啶(PI)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶(Tyrisin)購(gòu)自Promega公司,兔抗cyclin D1、cyclin E抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)于Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌Ec-109細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，每周傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。人食管癌Ec-109細(xì)胞為汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理室饋贈(zèng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況 將細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，含5×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、腫瘤細(xì)胞陰性對(duì)照組、姜黃素治療組，治療組中加入等體積不同濃度姜黃素。將培養(yǎng)板置于37℃，飽和濕度，5%CO2培箱中常規(guī)培養(yǎng)12、24、48 h后，各孔均加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，各孔均加入DMSO 150 μl，振蕩器上振蕩5 min溶解藍(lán)色結(jié)晶，混勻后以酶標(biāo)儀于490 nm處讀取各孔吸光度值(A490)。腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%，空白組吸光度值設(shè)為0值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況 姜黃素溶解于DMSO中，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋，樣品中DMSO終濃度<0.5%。細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，生長(zhǎng)至80%融合，加入稀釋終濃度為20、40、80 μmol/L姜黃素后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對(duì)照組不加姜黃素，胰酶消化，PBS洗滌細(xì)胞2次，離心(1000 r/min×10 min，離心半徑13.5 cm)。70%乙醇4℃固定過(guò)夜，碘化丙啶避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)。根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相分布情況計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)。Pl(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值。

1.2.4 Western-blot檢測(cè)cyclin D1、cyclin E表達(dá) 20、40、80 μmol/L的姜黃素分別作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞先經(jīng)冷PBS沖洗3遍，收集細(xì)胞(1×108/ml)，用加樣緩沖液裂解細(xì)胞，勻漿緩沖液(250 μmol/L Sucrose,20 μmol/L Hepes/KOH，pH 7.5，10 μmol/L KCl，1.5 μmol/L MgCl2，1 μmol/L EGTA，1 μmol/L EDTA，1 μmol/L DTT，0.1 μmol/L PMSF)400 μl重懸，移入玻璃勻漿器內(nèi)，于冰浴中勻漿5 min，離心(10 000 r/min×10 min，離心半徑9.5 cm)，收集上清，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，制備好的蛋白樣品置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)12%聚丙烯酞胺凝膠SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜。室溫封閉3 h，加兔抗cyclin D1、cyclin E抗體，室溫下孵育2 h，再加HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫下孵育1 h，采用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色約2 min，以β-actin蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照，待蛋白條帶顯色清晰時(shí)，拍攝照片，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)行方差分析，如有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義再行均數(shù)間多重比較。采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制細(xì)胞增殖情況

20、40、80 μmol/L姜黃素分別作用于食管癌EC-109細(xì)胞12、24、48 h后，采用MTT法分析，證實(shí)細(xì)胞吸光度值隨作用時(shí)間延長(zhǎng)及藥物濃度增加而增大，實(shí)驗(yàn)組吸光度值與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.795，P<0.05)。相同時(shí)間組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)吸光度值兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)(F=71.40，P<0.00)，相同時(shí)間組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明姜黃素能抑制EC-109細(xì)胞的增殖，并呈一定的時(shí)間、劑量依賴關(guān)系，隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活性及增殖能力逐漸下降，見(jiàn)表1、表2。

2.2 姜黃素干預(yù)后細(xì)胞周期的比較

20、40、80 μmol/L姜黃素干預(yù)EC-109細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期各時(shí)相所占的比例不同，隨著姜黃素濃度的增大，G1/G0期所占比例對(duì)照組最低，為(51.46±3.22)%，20 μmol/L姜黃素組次之，80 μmol/L姜黃素組為(63.14±4.62)%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.27，P<0.05)，組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。對(duì)照組PI為(47.55±2.36)%，20、40、80 μmol/L姜黃素干預(yù)組PI分別降至(40.75±4.23)%、(31.26±3.67)% 、(22.78±2.02)%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.58，P<0.01)，組內(nèi)兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05，見(jiàn)圖1，表3。

表1 姜黃素作用后細(xì)胞吸光度值比較

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，F(xiàn)=64.95，P<0.00；相同時(shí)間組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)兩兩比較，P<0.05

表2 姜黃素作用后細(xì)胞增殖抑制率比較

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，F(xiàn)=71.40，P<0.00；相同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)或相同劑量組內(nèi)兩兩比較，P<0.01

表3 姜黃素作用后細(xì)胞周期變化情況

a為不同濃度姜黃作用后G0/G1期細(xì)胞數(shù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=6.27，P<0.05,且兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05；b為不同濃度姜黃素作用后PI比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=12.58,P<0.01,且兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05

圖1 3組裸鼠移植瘤剝離后的瘤體變化

2.3 姜黃素干預(yù)后cyclin D1、cyclin E變化情況

經(jīng)過(guò)Western-blot分析發(fā)現(xiàn)，20、40、80 μmol/L姜黃素分別作用EC-109細(xì)胞24 h后，β-actin蛋白表達(dá)水平無(wú)改變，cyclin D1、cyclin E表達(dá)逐漸下降，對(duì)照組蛋白條帶最寬，80 μmol/L組蛋白條帶最窄，說(shuō)明姜黃素干預(yù)后，cyclin D1、cyclin E表達(dá)水平逐漸下降，見(jiàn)圖2。

圖2 姜黃素對(duì)EC-109細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腫瘤細(xì)胞具有快速無(wú)限增殖能力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖已成為目前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)之一，實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)細(xì)胞增殖采用較多的方法為MTT法[6～9]。通過(guò)MTT法我們證實(shí)，與對(duì)照組比較，作用時(shí)間相同條件下，不同濃度的姜黃素均能夠不同程度抑制食管癌EC-109細(xì)胞增殖，其抑制細(xì)胞增殖程度與姜黃素劑量呈一定的依賴關(guān)系；相同濃度情況下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率亦逐漸下降。我們推斷姜黃素呈時(shí)間、劑量依賴性抑制食管癌EC-109細(xì)胞增殖。但由于MTT檢測(cè)法的局限性，我們無(wú)法說(shuō)明姜黃素抑制食管癌EC-109細(xì)胞增殖的途徑。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相的檢測(cè)，我們證實(shí)，與對(duì)照組比較，不同濃度姜黃素干預(yù)食管癌EC-109細(xì)胞24 h，能夠不同程度增大細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例，濃度越高，G0/G1期細(xì)胞比例越大，細(xì)胞增殖指數(shù)越小。說(shuō)明姜黃素能夠通過(guò)使細(xì)胞停滯于G0/G1期，阻止細(xì)胞周期進(jìn)程途徑來(lái)抑制食管癌EC-109細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期受控于一組被稱為細(xì)胞周期素的蛋白，它在細(xì)胞增殖分裂活動(dòng)中起重要作用。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期蛋白有8種，表達(dá)量隨細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)換而改變。在G1期主要有cyclin D1、cyclin E表達(dá)，是G1期進(jìn)展的限速調(diào)節(jié)分子。有研究表明，cyclin D1、cyclin E表達(dá)增多，細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期進(jìn)程加速，細(xì)胞增殖加速，而減少cyclin D1、cyclin E表達(dá)，能夠使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖[10～12]。通過(guò)Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度姜黃素分別干預(yù)食管癌EC-109細(xì)胞24 h后，cyclin D1、cyclin E表達(dá)量不同，姜黃素濃度越高，cyclin D1、cyclin E條帶越窄，說(shuō)明其表達(dá)越弱。我們推斷姜黃素能夠降低EC-109細(xì)胞表達(dá)cyclin D1、cyclin E。

綜上所述，我們推斷姜黃素能夠降低食管癌EC-109細(xì)胞表達(dá)cyclin D1、cyclin E，使細(xì)胞停滯于G0/G1期，起到抑制細(xì)胞增殖作用。但細(xì)胞周期阻滯只能部分解釋姜黃素抑制食管癌EC-109細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的亞二倍體凋亡峰提示誘導(dǎo)凋亡也是姜黃素的作用機(jī)制之一，這也被我們前期研究證實(shí)，但姜黃素抗腫瘤作用的分子信號(hào)途徑還遠(yuǎn)未被了解，有待今后進(jìn)一步深入研究。

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