張媚佳，歐冰雷，徐蘇凌，方 勇，徐根娣

（1.浙江師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江 金華 321007；3.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004）

磷是植物生命活動(dòng)所需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一。我國(guó)大多數(shù)農(nóng)田土壤磷素含量豐富，但95%以上以無(wú)效態(tài)積累于土壤中[1]，很難被植物直接吸收利用。目前，向土壤中施加可溶性磷肥是提高作物產(chǎn)量最常用的方法，但該法卻不能從根本上解決土壤缺磷的問(wèn)題，而且還會(huì)造成環(huán)境污染。研究表明，利用土壤中天然存在的具有溶磷能力的溶磷菌是避免土壤磷污染和解決植物生長(zhǎng)缺磷問(wèn)題的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。此外，有些溶磷菌還兼具分泌植物生長(zhǎng)素（IAA）的功能，對(duì)植物生長(zhǎng)起到了直接的促進(jìn)作用[2-3]。

苜蓿根瘤菌是一種良好的生物肥料[4-5]，同時(shí)還具有溶磷和分泌IAA的能力[6-7]。目前已有低pH和鋁脅迫對(duì)苜蓿根瘤菌生長(zhǎng)狀況的影響的報(bào)道，但對(duì)低pH下鋁脅迫對(duì)苜蓿根瘤菌溶磷和分泌IAA能力的影響的研究卻不多。本試驗(yàn)從生長(zhǎng)在金華酸性紅壤上的紫花苜蓿的根瘤中分離篩選出兩株根瘤菌S1002和S1007，并以此作為供試菌株，探究了酸性條件下Al3+對(duì)根瘤菌S1002，S1007溶解有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷和分泌IAA的能力的影響，旨在為根瘤菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 供試根瘤菌取自金華紅壤區(qū)種植的紫花苜蓿上的根瘤。菌株由實(shí)驗(yàn)室分離純化[8-9]，經(jīng)耐酸篩選后[10]獲得了在pH 5.0的YMA固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)的兩個(gè)菌種S1002和S1007作為研究對(duì)象。

1.1.2 培養(yǎng)基 有機(jī)磷測(cè)定培養(yǎng)基采用蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基，配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]；無(wú)機(jī)磷測(cè)定培養(yǎng)基采用PKO（Pikovskaia’smedium）無(wú)機(jī)培養(yǎng)基，配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11-12]；根瘤菌分泌IAA的能力的測(cè)定培養(yǎng)基采用改良的剛果紅液體培養(yǎng)基[11]；根瘤菌保存培養(yǎng)基采用YMA固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 酸性條件下Al3+對(duì)根瘤菌溶磷能力的影響采用溶磷圈法進(jìn)行溶磷能力的測(cè)定。在PKO和蒙金娜的液體培養(yǎng)基中（pH 5.0）分別添加0、3、6、9 μmol/L的AlCl3，添加2%的瓊脂粉，經(jīng)高壓滅菌后制成平板備用。將已制備好的根瘤菌懸液用無(wú)菌移液槍在無(wú)菌條件下點(diǎn)接到PKO和蒙金娜培養(yǎng)基上，每板點(diǎn)植5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)菌種重復(fù)3次，于28℃下培養(yǎng)。10 d后測(cè)量根瘤菌菌落直徑（d）和溶磷圈直徑（D），計(jì)算根瘤菌菌落溶磷透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值，根據(jù)（D/d）值的大小來(lái)判定酸性條件下Al3+對(duì)兩種根瘤菌溶磷能力的影響。

1.2.2 酸性條件下Al3+對(duì)根瘤菌分泌IAA能力的影響 采用Salkowski比色法[13]作根瘤菌分泌IAA能力的定性測(cè)定。在剛果紅液體培養(yǎng)基中（pH 5.0）分別添加0、3、6、9μmol/L的AlCl3，等量分裝到150 mL的三角瓶中，經(jīng)高壓滅菌后備用。用移液槍在無(wú)菌條件下移取等量的根瘤菌懸液至各三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速125 r/min，溫度28℃的搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后，取其菌懸液100μL滴于白色陶瓷板上，加100μL的比色液，在室溫下靜置15 min后觀察顏色變化，每個(gè)菌種3個(gè)重復(fù)。3個(gè)重復(fù)均變紅為陽(yáng)性，表示能分泌IAA，顏色越深表明分泌量越多，3個(gè)重復(fù)均不變色為陰性，表示不分泌IAA。

用標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)作根瘤菌分泌IAA能力的定性分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用純3-IAA制作[14]。根瘤菌的測(cè)定是將根瘤菌懸液取出后，在10 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加比色液在黑暗中靜置0.5 h，取出立即在波長(zhǎng)530 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到IAA的分泌量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel2003進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性條件下Al3+對(duì)根瘤菌溶磷能力的影響

菌株的溶磷圈直徑（D）和菌落生長(zhǎng)直徑（d）的比值（D/d）是表征菌株的溶磷效果的重要指標(biāo)[15-16]。從圖1可以看出，分離篩選出的兩個(gè)菌株S1002和S1007都能溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷，且溶解無(wú)機(jī)磷的能力強(qiáng)于有機(jī)磷。在相同條件下，S1007的溶磷量大于S1002，表明菌株S1007具有更優(yōu)的溶磷效果。隨著Al3+濃度的增加，S1002和S1007的溶磷量降低，表明兩種菌株對(duì)Al3+有一定的耐受性，但其溶磷作用受到了抑制。

圖1 兩種根瘤菌在不同Al3+濃度下的溶磷量

2.2 酸性條件下Al3+對(duì)根瘤菌分泌植物IAA能力的影響

通過(guò)試驗(yàn)對(duì)兩種耐酸根瘤菌分泌植物IAA能力進(jìn)行了定性和定量的測(cè)定。結(jié)果如表1所示，在Al3+濃度較低的情況下，菌株S1002和S1007仍具有分泌IAA的能力，但隨著Al3+濃度的增加，IAA的分泌量減少，當(dāng)Al3+濃度達(dá)到9μmol/L時(shí)，不能觀察到顯色變化。

表1 兩種苜蓿耐酸根瘤菌分泌IAA的能力

定量測(cè)定結(jié)果與定性測(cè)定結(jié)果基本一致（圖2）。隨著Al3+濃度的增加，兩者的IAA分泌量減少，但在Al3+濃度為9μmol/L時(shí)，定量測(cè)定時(shí)仍可檢測(cè)到IAA，該結(jié)果與定性測(cè)定結(jié)果不一致，這表明IAA需要累積到一定量時(shí)才能通過(guò)Salkowski比色法檢測(cè)到。由此可見(jiàn)，定量測(cè)定的結(jié)果更為準(zhǔn)確。

3 討論

圖2 兩種根瘤菌在不同Al3+濃度下的IAA分泌量

近年來(lái)，已有眾多學(xué)者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿根瘤菌具有促進(jìn)苜蓿、小麥[17]、燕麥[18]、雞骨草[19]等多種植物生長(zhǎng)的作用。在中性條件下，部分苜蓿根瘤菌不僅具有固氮活性，而且還具有溶磷作用[11]。本試驗(yàn)采用溶磷圈法，以分離得到的兩株在pH 5.0的TMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最優(yōu)的根瘤菌菌株作為研究對(duì)象，探究了酸性條件下Al3+對(duì)兩種根瘤菌溶磷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）兩個(gè)菌株都具有較強(qiáng)的溶磷能力，且溶解無(wú)機(jī)磷的能力強(qiáng)于溶解有機(jī)磷的能力，這可能是因?yàn)檐俎８鼍墓采匦允怪畠A向于與無(wú)機(jī)體結(jié)合，因而強(qiáng)化了溶解吸收有機(jī)體營(yíng)養(yǎng)元素的能力。（2）酸性條件下Al3+的存在對(duì)兩個(gè)菌株的溶磷作用均具有一定的抑制作用，且這種抑制作用隨著Al3+濃度的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)Al3+濃度增加到9μmol/L時(shí)，兩個(gè)菌株的溶磷量卻增加了。分析原因可能是因?yàn)殡S著Al3+濃度升高，毒害作用增強(qiáng)，進(jìn)一步刺激根瘤菌分泌出了檸檬酸等具有解鋁毒作用的酸，從而減小了Al3+對(duì)根瘤菌的毒害作用，對(duì)其溶磷的抑制作用也相應(yīng)的降低[20]。

本試驗(yàn)采用Salkowski比色法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對(duì)根瘤菌在不同Al3+濃度下分泌植物IAA的量分別進(jìn)行了定性和定量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兩種苜蓿根瘤菌在酸鋁脅迫下仍具有較強(qiáng)的分泌IAA的能力。在酸性條件下，Al3+對(duì)兩種根瘤菌分泌IAA具有抑制作用，且這種抑制作用隨著Al3+濃度的增加而增強(qiáng)。此外，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，S1007分泌IAA的能力大于S1002，分析原因可能是因?yàn)镾1007的生長(zhǎng)較S1002旺盛，因而分泌IAA的效率更高，產(chǎn)量更多。

綜上所述，菌株S1002和S1007均具有較為優(yōu)異的溶磷和分泌IAA的能力，且溶解無(wú)機(jī)磷的能力更強(qiáng)；溶磷和分泌IAA的能力都會(huì)受到Al3+的影響，Al3+濃度增加，抑制作用增強(qiáng)；菌株S1007的溶磷和分泌IAA能力均較S1002強(qiáng)，表明菌株S1007的性能更優(yōu)。

[1] 王光華，周可琴，金 劍.不同碳源對(duì)三種溶磷真菌溶解磷礦粉能力的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（2）：32-36.

[2] Okeny.Root associative azosprillum species can stimulateplants[J].ASM News，1997，63（7）：366-370.

[3] Datta M，Banik S，Gupta R K.Studies on the efficacy of a phytohormone producing phosphate solubilizing Bacillus firmus in augmenting paddy yield in acid soils of Nagaland[J].Plant and Soil，1982，69：365-373.

[4] 王 平，王 勤，馮新梅，等.華癸根瘤菌在非豆科植物根圈定殖能力的研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，18（3）：238-242.

[5] Barraquio W L，Revilla，Ladha J K.Isolation of endophytic di-azotrophic bacteria from wetland rice[J].Plant and Soi，1997，194：15-24.

[6] 祁 娟，師尚禮.不同品種紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌溶磷和分泌生長(zhǎng)素能力[J].草原與草坪，2006，118：18-20.

[7] 師尚禮，曹致中，劉建榮.苜蓿根瘤菌溶磷和分泌植物生長(zhǎng)素能力研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，165（1）：105-111.

[8] 王小平，楊建周，徐京生，等.奶花蕓豆根瘤菌的分離及回接試驗(yàn)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，38（2）：76-77.

[9] 陳海榮，郭照輝，劉前剛，等.紫云英根瘤菌培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（1）：13-15.

[10]張 琴，李艷賓.六株耐酸苜蓿根瘤菌的篩選及生長(zhǎng)特性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（9）：1-10.

[11]師尚禮，曹致中，劉建榮.苜蓿根瘤菌溶磷和分泌植物生長(zhǎng)素能力研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（1）：105-111.

[12]李 娟，王文麗，盧秉林，等.甘肅省河西高鈣土溶磷菌篩選及其溶磷能力初步研究[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，26（2）：7-10.

[13]Glickmann E，Dessaux Y.A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology，1995，619（2）：793-796.

[14]李振東，陳秀蓉，李 鵬，等.珠芽蓼內(nèi)生菌Z5產(chǎn)IAA和抑菌能力測(cè)定及其鑒定[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19（2）：61-68.

[15]Louw H A，Webley D M.A study of soil bacteria dissolving certainmineral phosphate fertilizers and related compounds[J].Appl Bacterio，l1959，22：227-233.

[16]蔡 磊，李文鵬，張克勤.高效解磷菌株的分離、篩選及其對(duì)小麥苗期生長(zhǎng)的促進(jìn)作用研究[J].土壤通報(bào)，2002，33（1）：44-46.

[17]馬天瑞，藍(lán)祖慶.對(duì)小麥有促生作用的苜蓿根瘤菌篩選初報(bào)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16（21）：32-33.

[18]馬天瑞，藍(lán)祖慶.苜蓿根瘤菌對(duì)燕麥促生作用的研究初報(bào)[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，16（23）：62-63.

[19]黃榮韶，玉永雄，胡 艷，等.接種根瘤菌對(duì)雞骨草幼苗生長(zhǎng)、結(jié)瘤和固氮能力的影響[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，25（3）：252-255.

[20]羅獻(xiàn)寶.酸鋁脅迫對(duì)苜蓿的影響研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2003.