馬永光，于翠梅，楊 巍，徐振峰

（1.沈陽市農(nóng)業(yè)科學院，遼寧沈陽 110034；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學，遼寧沈陽 110161；3.中國種子集團，遼寧沈陽 110034）

共培養(yǎng)從廣義上講是將2種生物在一起培養(yǎng)并使其發(fā)生相互作用。該文中的共培養(yǎng)是指用攜帶目的基因片段的微生物和植物的愈傷組織在一起進行培養(yǎng)，從而使微生物中的目的基因轉(zhuǎn)移到植物愈傷組織中，達到轉(zhuǎn)基因的目的。

農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)常采用固體培養(yǎng)基，也可采用液體培養(yǎng)基，但應用較少。采用固體培養(yǎng)基時，可將外植體直接放在上面培養(yǎng)，也可在培養(yǎng)基上鋪1～2層濾紙，然后再放外植體進行共培養(yǎng)。放濾紙可控制外植體上農(nóng)桿菌的過度增殖。該試驗通過對影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系共培養(yǎng)的方法進行試驗比較，對以往的共培養(yǎng)方法進行了部分優(yōu)化，并進行了比較。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為水稻品種日本晴。

1.2 供試菌種

農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)采用攜帶有潮霉素抗性載體pCambial300，根癌農(nóng)桿菌LBA4404。

1.3 外植體的獲得

取飽滿、色澤好的水稻種子，去殼，用無菌水簡單沖洗2遍后，用70%乙醇殺菌1.5 min，再用含有2.5%的次氯酸鈉殺菌15 min，其中每50 mL次氯酸鈉含有1滴吐溫20，最后再用無菌水清洗5遍。在N6D（加入2,4－D的N6培養(yǎng)基）誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)（圖1）。將誘導培養(yǎng)10 d左右的愈傷組織有選擇地轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上（圖2）。采用26℃暗培養(yǎng)，時間控制在7～10 d，可出現(xiàn)大量狀態(tài)良好的愈傷組織。以后每10 d繼代1次，挑選色澤淡黃、質(zhì)地細膩、柔軟的愈傷組織進行共培養(yǎng)。也可在誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d左右，直接選取質(zhì)量優(yōu)良的愈傷組織進行共培養(yǎng)。

圖1 日本晴2.5%次氯酸鈉處理后培養(yǎng)4 d

圖2 日本晴誘導培養(yǎng)10 d

1.4 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

將含有目的基因載體的農(nóng)桿菌在含有50 mg/L Kanamycin的YM平板上劃線，在28℃下暗培養(yǎng)3 d，用一金屬匙收集農(nóng)桿菌菌體（一小撮即可），使之懸浮于AAM培養(yǎng)基中，調(diào)整菌體濃度至OD600近似等于0.1，加入AS，使其最終濃度為100 mol/L，即為共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化水稻用的農(nóng)桿菌懸浮液。

1.5 外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)

通常情況下，共培養(yǎng)時都用共培養(yǎng)基培養(yǎng)。該試驗在共培養(yǎng)時未采用共培養(yǎng)基，而是利用簡單的被0.5 mL AAM培養(yǎng)基浸濕的無菌濾紙，將侵染過后的愈傷組織轉(zhuǎn)移其上進行共培養(yǎng)。共培養(yǎng)時間要精確控制在2～3 d，時間短（共培養(yǎng)2 d以下），農(nóng)桿菌侵染效果不明顯，則有部分愈傷組織未被侵染；共培養(yǎng)時間過長（3 d以上），愈傷組織易大量染菌，轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，愈傷組織周圍會長出大量農(nóng)桿菌，不利于篩選。

從繼代培養(yǎng)上挑選狀態(tài)較好的愈傷組織，一般是繼代培養(yǎng)5～7 d，顆粒分明，色澤淡黃，質(zhì)地細膩柔軟的愈傷組織，放入100 mL無菌三角瓶中，加入適量農(nóng)桿菌懸浮液（懸浮液的量要保證有足夠的菌液與材料相接觸），在室溫下放置20 min，并不時搖晃或放到搖床上慢搖。再倒掉菌液，將愈傷組織放在無菌濾紙上吸去多余的菌液。然后采取2種不同的共培養(yǎng)方法：①轉(zhuǎn)移到鋪有1層無菌濾紙的固體共培養(yǎng)基上(圖3a)，28℃暗培養(yǎng)，時間嚴格控制在2～3 d之間，時間過短浸染效果不明顯，時間過長，愈傷組織染菌。②無菌濾紙用0.5 mL AAM培養(yǎng)液浸濕（圖3b），鋪在培養(yǎng)皿中，然后直接將侵染過后的愈傷組織在其上進行共培養(yǎng)。

2 d后轉(zhuǎn)至篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基采用含有50 mg/L的潮霉素和400 mg/L的羧芐青霉素的N6D培養(yǎng)基，對愈傷組織進行2次篩選，觀察2個篩選時間段上的效果和產(chǎn)生抗性愈傷組織的比率。

2 結(jié)果與分析

從圖3a與圖3b比較來看，在共培養(yǎng)階段，2種共培養(yǎng)方法中愈傷組織并無明顯差別。

圖3 2種共培養(yǎng)方法的培養(yǎng)效果

篩選階段是通過藥品選擇抗性愈傷組織，愈傷組織成功轉(zhuǎn)化在這個階段就可以體現(xiàn)出來。這時，愈傷組織的生長狀態(tài)會發(fā)生明顯變化，非抗性愈傷會死亡，抗性愈傷會重新生長。2次篩選的愈傷組織的狀態(tài)如圖4所示。

圖4 2次篩選的愈傷組織

將共培養(yǎng)后的愈傷組織放在含有50 mg/L潮霉素和400 mg/L的羧芐青霉素的篩選培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)14 d，再轉(zhuǎn)到新配制的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)進行第2次篩選。大部分愈傷組織在篩選10 d左右褐化，然后在褐化組織的邊緣重新生長出乳白色的抗性愈傷組織。

通過培養(yǎng)效果比較及篩選培養(yǎng)過程中抗性愈傷組織的比例（表1）可以看出，采用2種方法共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化愈傷組織，在篩選培養(yǎng)過程中都獲得了較高頻率的抗性愈傷組織。但是直接用濾紙的這種方法簡單易行，便于操作，利于控制愈傷組織染菌，客觀上利于增加產(chǎn)生抗性愈傷組織的比例。

表1 2種共培養(yǎng)方法下日本晴產(chǎn)生抗性愈傷組織的比率

3 討論

共培養(yǎng)階段是農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期，農(nóng)桿菌對愈傷組織的侵染過程，也是農(nóng)桿菌攜帶的基因片斷向愈傷組織細胞轉(zhuǎn)化的過程。共培養(yǎng)時間一般是2～3 d。通常在這個階段都將愈傷組織在農(nóng)桿菌懸浮液中慢搖培養(yǎng)20 min后，吸干菌液，然后放到鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)。共培養(yǎng)基的作用是給愈傷組織提供足夠的營養(yǎng)。該試驗中，直接將懸浮培養(yǎng)后的愈傷組織放在浸有0.5 mL AAM液體培養(yǎng)基的無菌濾紙上培養(yǎng)，取得了更好的效果。

在愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，含有目的基因的T-DNA片段已轉(zhuǎn)移至受體細胞，并整合到受體細胞的基因組中，實現(xiàn)了外源基因。此時，農(nóng)桿菌細胞和受體植物細胞同時增殖生長，而農(nóng)桿菌的生長繁殖會嚴重影響受體植物細胞的生長。而直接用吸過農(nóng)桿菌懸浮液的濾紙進行共培養(yǎng)，其過程時間短，濾紙中AAM液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)就可維持愈傷組織的短期生長，同時客觀上有效控制了農(nóng)桿菌繁殖數(shù)量，保護了植物細胞，不易出現(xiàn)愈傷組織過度染菌的現(xiàn)象，避免在篩選時加大抗生素用量所帶來的不良后果。

這種方法省去了配制固體培養(yǎng)基的大量繁瑣的工作，方法簡單易于操作，減少了污染機會，能夠保障試驗順利有效地進行，同時節(jié)省配制培養(yǎng)基的藥品，節(jié)約試驗成本。

利用農(nóng)桿菌介導法進行水稻轉(zhuǎn)基因時，在共培養(yǎng)階段用浸有0.5 mL AAM培養(yǎng)液的無菌濾紙直接鋪在培養(yǎng)皿中，將侵染過后的愈傷組織在其上進行共培養(yǎng)，既能保證農(nóng)桿菌侵染植物愈傷組織的質(zhì)量，又能減少試驗污染，節(jié)約成本，簡便實用。

[1]裴中有,孫守鈞,李玲,等.農(nóng)桿菌介導粳稻高效轉(zhuǎn)化體系的研究[J].華北農(nóng)學報,2005,20(3):10-13.

[2]張毅,汪秀峰,李莉,等.農(nóng)桿菌介導水稻幼胚轉(zhuǎn)化體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2004,32(4):637-639.

[3]段承俐,Carl Rathus.農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化為目的的水稻組培體系的建立[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報,2001,23(6):527-531.

[4]王蘭,田華.根癌農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(30):14594-14596.

[5]傅亞萍,斯華敏.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化花粉愈傷組織獲取純合的轉(zhuǎn)基因水稻植株[J].浙江大學學報,2001,27(4):407-410.

[6]尹中朝,楊凡.利用根癌農(nóng)桿菌獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株及其后代[J].遺傳學報，1998,25(6):517-524.

[7]駱開明.農(nóng)桿菌介導的雙SBE基因RNAi載體對水稻的遺傳轉(zhuǎn)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(7):2740-2742.

[8]王世權(quán).農(nóng)桿菌介導的水稻基因轉(zhuǎn)化[J].西南農(nóng)業(yè)學報,1999(12)86-90.

[9]周玲艷,姜大剛,吳豪,等.農(nóng)桿菌介導水稻轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2003,24(3):43-45.

[10]劉巧泉,張景六.根癌農(nóng)桿菌介導的水稻高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究[J].植物生理學報，1998,24(3):259-271.

[11]曹孟良.農(nóng)桿菌介導的水稻高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報，1999,25(5):349-356.