王珊，劉瑀，張松

(大連海事大學(xué)環(huán)境信息研究所，遼寧大連116026)

由于船舶和其它海上漏油事故頻繁發(fā)生，石油污染對海洋環(huán)境的影響也越來越受到人們的廣泛關(guān)注。一方面，溢出油在海面上形成了一層油膜，阻斷了海水與大氣間的氣體交換，產(chǎn)生遮光作用，可使水體缺氧，造成生物缺氧死亡;另一方面，海上溢油后，其中的多環(huán)芳烴類化合物可被海洋生物吸收蓄積，產(chǎn)生毒害作用［1］。由于多環(huán)芳烴類化合物難于被降解，對海洋生物的危害將是長期的［2－3］，而蓄積于生物體內(nèi)的毒物將沿著食物鏈進一步放大。人類若食用了被石油污染的海洋生物，將對其健康造成較大的危害。

孔石莼Ulva pertusa是綠藻門Chlorophyta、輪藻綱Ulvophyceae、石莼目Ulvales、石莼科Ulvaceae、石莼屬Ulva的一種大型海洋經(jīng)濟藻類，廣泛分布于西太平洋沿海［4］。溢油事故發(fā)生后如果未及時清理，油就會隨著海水漂流到海岸上，對海岸帶造成污染。目前，石油烴類污染物已成為中國近海僅次于營養(yǎng)鹽富營養(yǎng)化的第二大污染物［5］。關(guān)于石油烴污染物對海洋生態(tài)系統(tǒng)中浮游生物、魚、蝦、貝的影響已有較多報道［6－15］，但關(guān)于石油烴對大型藻類生長及光合作用影響的研究報道相對較少［16］。本試驗中，作者研究了船舶燃油(L.D.O.)、船用潤滑油(簡稱潤滑油)和沙特阿拉伯輕質(zhì)原油(簡稱沙輕原油)等3種船舶常用油對孔石莼生長和光合作用的影響，以期為評估溢油污染對大型藻類的生理、生態(tài)影響提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用孔石莼和海水于2010年4—5月取自大連市黑石礁海域。海水經(jīng)過砂濾凈化、脫脂棉過濾和煮沸處理，放置至室溫后使用。

試驗用3種油品:L.D.O.采自連山2號船;沙輕原油和潤滑油采自大連海事大學(xué)教學(xué)實習(xí)船“育鯤”輪。

試驗儀器主要有:光照培養(yǎng)箱 (上海博泰實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)，SPX－GB－300);超聲波清洗器 (寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)，SB5200D7);紫外分光光度計 (上海天美科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，UV1102)。

1.2 方法

1.2.1 孔石莼的暫養(yǎng) 選擇色澤鮮綠的孔石莼，用處理過的海水反復(fù)沖洗藻體表面以去除雜質(zhì)，在光照培養(yǎng)箱中暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間，每天更換海水1次，不充氣，每日搖瓶3～4次。培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，鹽度為30，pH為8.2，光照強度為5000 lx，光照周期為L∶D=12∶12。試驗前在藻體近邊緣部位用打孔器取直徑為1 cm的圓片(0.0100 g±0.008 g)，置于光照培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2 d，備用。

1.2.2 石油烴水溶解組分母液的配置 將3種油品和海水按照1∶5的比例混合于燒杯中，在超聲波清洗器中連續(xù)震蕩3 h，靜置分層后分離水相，于低溫 (4±1℃)下保存［17－18］，即形成了 3 種石油烴水溶解組分——L.D.O.石油烴水溶解組分、沙輕原油石油烴水溶解組分和潤滑油石油烴水溶解組分。

1.2.3 試驗設(shè)計 采用紫外分光光度法測定母液中石油烴的濃度［19］。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，將3種石油烴水溶解組分母液按照如下濃度稀釋作為石油烴受試液:L.D.O.和沙輕原油石油烴的濃度分別為0、5、10、15、25、50 mg/L，潤滑油石油烴濃度分別為0、5、10、20、25、50、100 mg/L。每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。試驗容器為250 mL的錐形瓶，每瓶中加入試液200 mL，并隨機放入2片孔石莼。放入前，將孔石莼在濾紙上吸干水分后稱濕重。試驗條件與預(yù)培養(yǎng)條件相同。試驗過程中用兩層保鮮膜將錐形瓶口密封，每日搖瓶3～4次，試驗時間為96 h。試驗結(jié)束后稱濕重，之后轉(zhuǎn)移至黑白瓶中，24 h后測定孔石莼的光合速率和呼吸速率 (瓶中培養(yǎng)液為清潔海水)，之后隨機取3片孔石莼用于測定干重，其余3片孔石莼采用分光光度法測定葉綠素a的含量［19］。采用碘量法測定溶解氧。

1.3 計算公式與數(shù)據(jù)處理

特定生長率(%/d)、光合速率(mg/(g·h))和呼吸速率(mg/(g·h))的計算公式如下［20］:

式中:Wt為時間t(d)時藻片的濕重 (g);W0為試驗初始時藻片的濕重 (g);t為試驗時間 (d);OA1、OA2分別為盛有藻片的白瓶和黑瓶24 h后的溶解氧;Ow、OB分別為白瓶、黑瓶的空白對照，即未盛藻片的白瓶、黑瓶24 h后的溶解氧;A為藻體的最終濕重 (g)。

采用PASW Statistics 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的石油烴對孔石莼生長和葉綠素含量的影響

圖1為孔石莼暴露于3種石油烴不同濃度條件下的特定生長率?？资辉谳^低的石油烴濃度下均可存活，但當石油烴濃度升高到一定量時(L.D.O.=50 mg/L，沙輕原油=50 mg/L，潤滑油=100 mg/L)，藻片顏色開始從邊緣變淺、發(fā)白，96 h后內(nèi)全部死亡。從圖1可見:在L.D.O.和沙輕原油石油烴不同濃度溶液中，孔石莼的特定生長率表現(xiàn)出隨濃度的增加先下降、后上升、再下降的趨勢，特別是在L.D.O.石油烴的不同濃度中，下降趨勢比較明顯;而在潤滑油石油烴各濃度溶液中，孔石莼的特定生長率則未表現(xiàn)出明顯的下降趨勢。暴露于3種石油烴不同濃度溶液中孔石莼的特定生長率與石油烴暴露濃度之間無顯著相關(guān)性。

圖1 3種石油烴不同濃度條件下孔石莼的特定生長率Fig.1 Specific growth rates(SGR)of Ulva pertusa exposed to different oil concentrations

由圖2可見，孔石莼的葉綠素a、b含量的變化趨勢較為復(fù)雜，基本呈波浪式變化。在潤滑油石油烴溶液中，隨著暴露濃度的升高，孔石莼葉綠素a、b含量都呈先下降、后上升、再下降的趨勢;而在L.D.O.和沙輕原油石油烴各濃度溶液中，葉綠素a、葉綠素b的值則呈先上升、后下降、再上升的趨勢。在沙輕原油石油烴各濃度溶液中，葉綠素a/葉綠素b的值呈現(xiàn)出隨濃度的升高而依次降低的趨勢，與暴露濃度呈顯著負相關(guān) (R=－0.942;P=0.017);在潤滑油石油烴溶液中，葉綠素a含量與暴露濃度呈顯著負相關(guān) (R=－0.815;P=0.048)。

圖2 3種石油烴不同濃度條件下孔石莼的葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll a and b contents of Ulva pertusa exposed to different oil concentrations

2.2 不同濃度的石油烴對孔石莼光合作用的影響

由圖3可見:在不同濃度潤滑油石油烴溶液中，孔石莼的光合速率表現(xiàn)出隨暴露濃度增加而下降的趨勢;而在不同濃度沙輕原油石油烴溶液中則表現(xiàn)出明顯的上升、下降、再上升、再下降的趨勢;在不同濃度L.D.O.石油烴溶液中，孔石莼的光合速率表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。相關(guān)分析結(jié)果表明，孔石莼的光合速率隨沙輕原油石油烴暴露濃度的增加呈顯著正相關(guān) (R=0.881;P=0.048)，而孔石莼光合速率與潤滑油石油烴暴露濃度呈顯著負相關(guān) (R=－0.881;P=0.02)。

圖3 3種石油烴不同濃度條件下孔石莼的光合速率Fig.3 Photosynthetic rates of Ulva pertusa exposed to different oil concentrations

從圖4可見，孔石莼的呼吸速率在3種石油烴不同濃度溶液中均表現(xiàn)出隨暴露濃度的增加而下降的趨勢。在沙輕原油石油烴溶液中，孔石莼的呼吸速率與石油烴暴露濃度呈顯著負相關(guān) (R=－0.924;P=0.025);在另外兩種石油烴溶液中，孔石莼的呼吸速率則呈現(xiàn)出隨暴露濃度的增加先急劇下降，之后維持在一定水平的趨勢。

圖4 3種石油烴不同濃度條件下孔石莼的呼吸速率Fig.4 Respiratory rates of Ulva pertusa exposed to different oil concentrations

3 討論

石油的成分很復(fù)雜，但其主要成分為液態(tài)烴(包括烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等)［21］。油類中各種石油烴類的含量不同，所以對不同生物產(chǎn)生的影響也大不相同，甚至對同種生物不同發(fā)育階段和各方面產(chǎn)生的影響也有差異。也就是說，石油對生物產(chǎn)生的影響大小取決于油的種類、濃度及生物種類［9］。Bate等［6］的研究結(jié)果表明，不同種群對各種油的反應(yīng)以及浮游植物代謝碳水化合物的能力均有差異。劉娜等［11］的研究結(jié)果表明，輕質(zhì)油對小球藻的毒性大于重質(zhì)油。吳彰寬等［13］研究了23種毒物對中國對蝦的急性毒性，發(fā)現(xiàn)石油烴和其產(chǎn)物的毒性大小順序為:汽油﹥煤油﹥輕柴油﹥原油﹥潤滑油。

本試驗結(jié)果表明，3種石油烴對孔石莼的生長、葉綠素a和葉綠素b的含量、光合速率及呼吸速率產(chǎn)生的影響都有一定的差異。從3種石油烴對孔石莼特定生長率的影響結(jié)果可以看出，在較低暴露濃度下，孔石莼能夠存活，直至油的濃度升高到一定程度才開始死亡 (圖1)。但試驗中導(dǎo)致孔石莼死亡時的石油烴濃度各不相同，推測L.D.O.和沙輕原油對孔石莼的毒性大于潤滑油。這一結(jié)果與吳彰寬等［13］的研究結(jié)果基本一致。

在3種石油烴不同濃度的溶液中，孔石莼的葉綠素a和葉綠素b的含量、光合速率及呼吸速率基本上隨著暴露濃度的升高而呈現(xiàn)波浪式的變化趨勢。其原因可能是，在石油烴類化合物作用下，導(dǎo)致藻類的細胞質(zhì)和葉綠體被瓦解，膜和色素化合物發(fā)生變化，一些光合作用酶的活性受到干擾等，從而影響藻類的葉綠素含量和光合速率［21］。

在L.D.O.和沙輕原油暴露試驗中，孔石莼的葉綠素含量隨著暴露濃度的升高呈現(xiàn)上升、下降、再上升的趨勢 (圖2)，而在沙輕原油暴露試驗中，孔石莼光合速率也呈現(xiàn)出相同的趨勢 (圖3)。這一現(xiàn)象與國內(nèi)外許多學(xué)者的研究結(jié)果相近。如Wolfe［9］曾指出，石油烴對海洋浮游植物生長的影響可以表現(xiàn)為促進作用，也可表現(xiàn)為抑制作用，這取決于石油烴的濃度和浮游植物的種類。王悠等［10］認為，金藻8701和骨條藻在低濃度 (1.56×10－6g/L)蒽 (多環(huán)芳烴的一種)的作用下，其生長呈現(xiàn)出較明顯的“毒性興奮效應(yīng)”，具體表現(xiàn)為細胞密度增加，蛋白質(zhì)、葉綠素a及類胡蘿卜素含量有所增加。究其原因，一是低濃度的石油烴可能對藻類產(chǎn)生刺激作用;二是藻類對石油烴的作用產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng);三是石油烴可能作為藻類生長的碳源和營養(yǎng)物質(zhì)［22］。一些研究結(jié)果表明，一定濃度的石油可以促進植物及浮游植物的生長［11，21，23］。一些學(xué)者通過對溢油事故后的海洋大型藻類進行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海藻對石油污染有較強的耐受能力［24－26］。因此，石油烴污染也可能是誘發(fā)海區(qū)赤潮或大型藻密度激增的原因之一。

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