龔 宇 張瑩雯

武漢大學中南醫(yī)院中西醫(yī)結合科,武漢 430071

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一,其基本病理改變?yōu)樵缙谀I小球血管功能異常和腎小球系膜外基質(ex tra cellular m atrix,ECM)進行性積聚,從而導致基底膜(glomerular basementmembrane,GBM)增厚,同時伴有腎小管-間質纖維化和彌漫性腎小球與結節(jié)性腎小球肥大、硬化。而腎小球系膜細胞(glom erular mesangial cell,GMC)是腎小球固有細胞中合成ECM最強的細胞,GMC增生、肥大及分泌的ECM進行性積聚是導致腎小球硬化的特殊間質效應細胞,在DN的發(fā)病中起關鍵作用。DN屬中醫(yī)學“消渴”證中的“下消”范疇,多為肝腎虧虛,瘀阻絡脈。臨床多采用益氣養(yǎng)陰、滋補肝腎、生津止渴、活血等中藥治療。本實驗通過體外培養(yǎng)的大鼠GMC,研究了當歸補血湯含藥血清對高糖條件下GMC增殖的影響,以探討當歸補血湯在預防DN發(fā)生、發(fā)展及DN時蛋白尿的作用,并為臨床應用當歸補血湯治療DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 實驗動物 50只清潔型SD成年雄性大鼠,體重180～200 g,4～6周齡,由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供,合格證號:[SCXK(鄂)2003-00004]。

1.1.2 藥材及試劑 當歸補血湯(由黃芪、當歸組成:5∶1),按要求稱取后,水浸泡30 m in后,煎3次,每次煎開10min后過濾取汁,將3次混合,并統(tǒng)一濃縮至2 kg/L藥液,由武漢大學中南醫(yī)院中藥房煎制;格列齊特,由湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司生產,批號:090707;鏈脲佐菌素(STZ),美國Sigm a公司;M TT溶液,凌飛科技;RPM I-1640培養(yǎng)液,美國Hyclone公司;胎牛血清(fetalbovine serum,FBS),杭州四季青生物工程材料公司提供;超凈工作臺,蘇州凈化;37℃5%CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱,美國Thermo Forma公司;Lambda25紫外分光光度計,美國PE公司;BIO-PROFIL凝膠成像系統(tǒng),法國Vilber Lov rma公司;Trizol試劑,美國Introgen公司;Genios Plus多功能酶標儀,奧地利TECAN公司;NF-κB一抗兔抗鼠及辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗兔多克隆抗體購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 所有大鼠禁食12 h后,其中42只一次性腹腔注射1%STZ 55.0mg/kg(溶于0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中,pH 4.2),72 h后取尾靜脈血,空腹血糖≥16.7mmol/L者納入實驗,隨機分為正常組(NC組,8只)、模型組(HG組,10只)、當歸補血湯低劑量組(DHG5組,8只)、當歸補血湯中劑量組(DHG10組,8只)、當歸補血湯高劑量組(DHG20組,8只)、格列齊特組(GL組,8只)。實驗第4日開始,每日定時灌胃,按大鼠與人等效劑量折算方法,GL組給予格列齊特1.5 mg/kg灌胃;DHG20組給予當歸補血湯3.6 g/kg灌胃,DHG10組給予當歸補血湯2.4 g/kg灌胃,DHG5組給予當歸補血湯1.2 g/kg灌胃,NC和HG不給藥,每日灌相同容量蒸餾水,1次/d。實驗期間自由飲水、進食,不使用胰島素及其他降糖藥物,連續(xù)8周,在末次灌胃10 h后麻醉,在無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血,離心取血清,56℃水浴30 m in滅活補體,經(jīng)過濾除菌,分裝凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 系膜細胞 在無菌條件下取出生3～5 d SD大鼠鼠嬰腎,去除腎胞膜,將皮質剪碎后用0.25%胰蛋白酶溶液消化,當細胞分散成單個時,用培養(yǎng)液終止消化,吹勻后接種于含20%的FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPM I-1640培養(yǎng)液中(用Hepes和NaHCO3調pH至7.2～7.4),分瓶后置37℃、5%CO2的飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),至90%匯合時,用0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代,傳代可獲得較純的腎小球系膜細胞。

1.2.3 GMC鑒定 ①倒置顯微鏡下觀察其典型的形態(tài)學特征:細胞鋪滿瓶底;②超微結構觀察:透射電鏡下GMC呈星形或梭形,胞質內除有少量分布的線粒體、粗面內質網(wǎng)、高爾基復合體外,還有最為特征性的是位于胞膜下和細胞突起向內的微絲結構,核居中央,多呈圓形或卵圓形,核染色質較為稀疏。

1.2.4 實驗分組 實驗分組NC組(常規(guī)培養(yǎng),僅20%正常大鼠血清)、HG(30 mmol/L D-glucose加10%FBS)、DHG5組(5%當歸補血湯含藥血清加30 mmol/L D-glucose加10%FBS)、DHG10組(10%當歸補血湯含藥血清加30 mmo l/L D-glucose加10%FBS)、DHG20組(20%當歸補血湯含藥血清加30 mm ol/L D-g lucose加10%FBS)及GL組(10%格列齊特含藥血清加30mmol/LD-glucose加10%FBS)。

1.2.5 M TT法檢測GMC的表達 用0.25%胰蛋白酶消化培養(yǎng)的GMC,再用含20%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)液稀釋為單個細胞懸液,以×104細胞密度接種于96孔培養(yǎng)板。24 h后細胞完全貼壁展開,用含1%胎牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)液24 h同步化細胞,每孔100μl,實驗分組同1.2.4,每組濃度設4個復孔,共種3個板(24、48和72 h各一塊板),其他條件相同。將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,分別培養(yǎng)到預定時間后,去上清,每孔加入M TT溶液(5 mg/ml,PBS)100μl,37℃避光繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng)。吸去孔內上清液,每孔加入100μl DMSO溶解液振蕩10 m in,待結晶物充分溶解后(溶液呈藍紫色),酶標儀上檢測各孔吸光度值(A570)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

在24 h內僅HG組增殖較快(P＜0.05),其余各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);在一定時間和相應糖濃度的作用下其增殖能力加強(48 h HG組與NC組相比,P＜0.05),隨著作用時間的延長和糖濃度的增加,其增殖能力更強(72 h HG組與NG組相比,P＜0.01),說明高糖有促進GMC增殖的作用。另外,不同含量的含藥血清對高糖條件下GMC增殖有一定的抑制作用,以DHG20和格列齊特組最為明顯(24、48 h與HG組相比,P＜0.05),并呈時間和計量關系(72 h與HG組相比,P＜0.01);而DHG10與HG組相比,僅在72 h有意義(P＜0.05);而DHG5、DHG10與DHG20組在作用的72 h相比,其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而GL組與DHG20組相比,其差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組24、48和72 h的GMC增殖情況(n=4,±s)

表1 各組24、48和72 h的GMC增殖情況(n=4,±s)

與NC組比較▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與HG組比較△P＜0.05,△△P＜0.01;與DHG20組比較#P＜0.05,##P＜0.01

組別24 h 48 h 72 h NC組1.195±0.074△1.193±0.100△1.252±0.123△△HG組0.839±0.050▲0.779±0.073▲0.589±0.084▲▲DHG 5組0.753±0.069##0.717±0.079##0.690±0.085##DHG 10組0.877±0.051##0.816±0.054##0.769±0.032△#DHG 20組1.189±0.044△1.108±0.047△0.946±0.098△△GL組1.182±0.062△1.087±0.065△0.872±0.047△△

3 討論

近年來,糖尿病患者迅猛增加,全球現(xiàn)有兩億多糖尿病患者,其中80%的患者生活在發(fā)展中國家[1],其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。糖尿病已成為繼心血管和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病[2]。DN是糖尿病最為嚴重的慢性并發(fā)癥之一,由DN引發(fā)的終末期腎功能衰竭(end-stage renal disease,ESRD)正在成為威脅糖尿病患者生命的主要原因。

DN基本病理特點為腎小球內高壓、高灌注、高濾過而出現(xiàn)微量蛋白尿,進而漸進性系膜擴張,GBM增厚和ECM積聚和足細胞的減少而出現(xiàn)大量蛋白尿,最后腎小囊玻璃滴狀病變,腎小球毛細血管袢纖維素樣或類脂樣帽狀病變和腎小球彌漫性、結節(jié)性硬化[3]。微量清蛋白尿是DN早期臨床診斷指標,而大量蛋白尿的出現(xiàn)則預示著腎小球病變不可逆轉,DN患者在短期內將進入終末期腎功能衰竭。腎小球濾過屏障是腎小球的重要結構,由內皮細胞、基底膜、足細胞及其裂孔隔膜三層結構所構成,濾過屏障的完整性在阻止蛋白質漏出中起關鍵作用。GBM作為濾過屏障的重要組成部分在蛋白尿的產生中起重要作用。

實驗發(fā)現(xiàn),與正常濃度葡萄糖組比較,隨著葡萄糖濃度增加,GMC出現(xiàn)明顯增殖時間縮短(P＜0.05或P＜0.01)。而MTT測定結果顯示:在相同濃度的葡萄糖作用下,隨著作用時間的延長,GMC增殖更加明顯(P＜0.01或P＜0.05),說明高糖可以促進GMC增殖,這與Wolf等[4-6]研究結果一致,在高糖(25 mmol/L glucose-DMEM)條件下,S期的GMC百分比明顯增加,G0/G1期的細胞百分比明顯減少[7]。通過用不同種類、不同濃度的含藥血清對不同濃度下的GMC干預后發(fā)現(xiàn),高濃度的當歸補血湯含藥血清對GMC增殖有較強的抑制作用,這種抑制作用與藥物作用時間和濃度呈正相關(在實驗的72 h,與NC組相比,DHG5組P＞0.05,DHG 10組P＜0.05,DHG20組P＜0.01),說明在DN條件下,高糖環(huán)境、GMC增殖在DN的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[8-9],推測抑制GMC增殖能有效的預防和治療高糖血癥誘導的腎臟損傷及DN的發(fā)生、發(fā)展。

DN屬中醫(yī)學的“腎消”、“下消”、“水腫”、“尿濁”、“關格”、“溺毒”等范疇。病變特點為肝腎陰虛為其本,肺胃燥熱為其標,痰、濕、濁、瘀為其因,氣血損傷,經(jīng)絡瘀阻為其變,陰陽俱虛、臟腑損傷及水濕潴留為其果。當歸補血湯源于金代李呆的《內外傷辨惑論?暑傷胃氣論》,全方由黃芪、當歸(5∶1)組成,又名黃芪當歸湯、補血湯、芪歸湯等,是中國傳統(tǒng)的補氣兼養(yǎng)血的代表方劑,主治勞倦內傷、氣弱血虛、陽浮外越,能增強免疫,調節(jié)血液系統(tǒng)及血糖含量,起到保護心血管系統(tǒng)、護肝及抗氧化等作用?，F(xiàn)代中藥藥理研究:當歸補血湯能夠改善DN大鼠GBM不規(guī)則增厚,足細胞排列紊亂且發(fā)生融合,腎小管上皮細胞腫脹,大量空泡變性,線粒體體積增大、形態(tài)變圓,線粒體嵴脫落;降低血糖、膽固醇、三酰甘油,提高高密度脂蛋白,逆轉腎臟肥大,腎重/體重的增加,改善系膜增生,進而減輕ECM積聚和腎臟肥大[10]。還能有效地降低腎小球和腎小管TGF-β1m RNA表達量[11];此外歸芪方能改善血糖及脂質代謝紊亂,并能降低尿微量清蛋白及β2-微球蛋白排泄率,緩解腎損傷[12];林為民等和徐寧等[13-14]通過大量的臨床觀察也證明當歸補血湯對DN的明顯改善作用。本實驗發(fā)現(xiàn)當歸補血湯可明顯抑制GBM的增殖,加強濾過屏障的保護作用,恢復正常的電荷屏障,改善蛋白尿,從而延緩DN的病情進展,保護腎功能。但其抑制高糖條件下GBM增殖的作用機制還須進一步研究。

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