王鵬琴,周鴻飛,王健,李敬林

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眼針對局灶腦缺血再灌注大鼠腦組織及血液腫瘤壞死因子含量的影響

王鵬琴,周鴻飛,王健,李敬林

(遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,沈陽 110032)

探討眼針療法治療缺血性腦血管病的可能機制。采用隨機分組將大鼠分為假手術(shù)組、模型組與眼針組,改良的線栓方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型;取上焦區(qū)、下焦區(qū)、肝區(qū)、腎區(qū)為施加因素;采用ELISA法檢測大鼠腦組織及血液TNF-a含量。眼針組與模型組腦組織及血液TNF-a含量比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。眼針可降低缺血半暗區(qū)皮層腦組織及血液中TNF-a含量。這可能是眼針治療缺血腦血管病機制之一。

針刺;眼針;腦缺血;腫瘤壞死因子;大鼠

目前腦血管病已成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病,其中缺血性腦血管病的發(fā)病率占腦血管病75%～80%。腫瘤壞死因子-a(TNF-a),既可以作為炎性細胞因子參加缺血性腦損傷的炎癥反應(yīng),也可以作為神經(jīng)細胞凋亡誘導(dǎo)因子參與神經(jīng)細胞凋亡過程。眼針療法治療缺血性腦血管病療效肯定。本研究從眼針對腦組織及血液中TNF-a的影響探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物分組

選擇健康雄性SD大鼠90只,由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。體重(260±20)g,隨機分為假手術(shù)組、眼針組與造模組,每組再分為3 h、24 h、72 h時間點三個亞組。

1.2 材料與試劑

試劑盒組成為96孔微孔板1塊,已包被抗大鼠TNF-a單抗,樣品稀釋液1瓶,第一抗體工作液1瓶,酶標抗體工作液1瓶,底物稀釋液1瓶,終止液1瓶,洗滌液(20×)1瓶,標準品(凍干粉,4000 pg/mL)兩管,OPD片3片,坐標紙1張。

1.3 模型制作方法

1.3.1 模型制作栓線的處理

取3.0號釣魚用尼龍絲線剪成長45 mm栓線,將頭端火焰燒成光滑球面,直徑為0.25～0.28 mm,距球面30 mm處用修正液做標記,乙醇消毒后置生理鹽水中備用。

1.3.2 模型制作

參照Longa[1]改良的線栓方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術(shù)前禁食12 h,不禁水,10%水合氯醛 (330 mg/kg)腹腔麻醉,消毒頸部皮膚,沿頸中線偏右做一長度約1 cm切口,仔細分離暴露出右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈根部,在右側(cè)頸總動脈分叉處以眼科剪剪一“V”形小口,將尼龍線從小口緩慢插入,經(jīng)頸總動脈分叉處進入右側(cè)頸內(nèi)動脈入顱,繼續(xù)輕柔推進,當感到有一定阻力時即停止推送,此時栓線進入深度 1.8～2.0 cm,栓線頭端正好位于大腦中動脈起始部位,阻斷血流。如栓線進入深度1.0 cm就感阻力,可緩慢退出,調(diào)整進線方向靠近頸內(nèi)動脈側(cè)再緩慢進入。結(jié)扎近端備線,防止栓線松動?？梢姶笫笥已酆缒ゎ伾儨\,出現(xiàn)右側(cè)Homer’s征。術(shù)中及術(shù)后保持室溫25℃左右,60 W的白熾燈照射動物以維持其肛溫在(37.5±0.3)℃。栓塞2 h后,再次麻醉,頭位固定,緩慢輕柔拔出1.0 cm尼龍線進行再灌注。將造模成功的大鼠經(jīng)神經(jīng)功能缺損評分,均衡分到模型組與眼針組。假手術(shù)組插線深度1.0 cm,其他同模型組。

1.3.3 動物模型的評價

參照Longa[1]5分制評分標準,0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側(cè)前爪;2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分為向?qū)?cè)傾倒;4分為不能自發(fā)行走,意識喪失。1～3分納入實驗。假手術(shù)組在清醒及隨后的時間未見明顯神經(jīng)功能缺損癥狀和體征,術(shù)后動物進食及活動恢復(fù)良好。

1.4 實驗方法

大鼠眼穴定位方法參照彭靜山教授著《眼針療法》[2],記載人體的眼穴劃分方法。取上焦區(qū)、下焦區(qū)、肝區(qū)、腎區(qū)。用0.35 mm×25 mm毫針在相應(yīng)眼穴區(qū)距眶內(nèi)緣2 mm處,平刺,由該區(qū)始點向該區(qū)終點方向刺入0.3 cm,行捻轉(zhuǎn)手法,留針30 min,15 min時行針一次,時間1 min。

針刺時機為再灌注即刻對動物神經(jīng)功能缺損評分,眼針組在缺血再灌注即刻及每隔12 h、處死前30 min進行眼針治療。

1.5 標本制作

將大鼠先以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(330 mg /kg)后,腹主動脈取血2 mL,4℃,3000×離心。取上清待測。取血后再斷頭取腦。用75%乙醇擦濕鼠頭部皮毛,從頸部斷頭,剝?nèi)ヮ^皮,用剪刀于顱骨上剪一小口,用血管鉗仔細鉗撬去顱骨充分暴露腦組織,用手術(shù)刀片切取缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg(冠狀面距額極7～11 mm,扇形分出缺血半暗帶一大腦縱裂到大腦外側(cè)溝皮層上1/3),迅速勻漿,制成10%組織勻漿液。

1.6 準備試劑與收集標本

1.6.1 洗滌液

用重蒸水1:20稀釋;實驗標本分別為血液和10%腦組織勻漿液;底物工作液配制使用前將OPD片放入底物稀釋液中溶解,每片加液5 mL;標準液配制使用前每管中加入蒸餾水200mL溶解后即用。

1.6.2 操作方法

本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測大鼠腦組織及血液TNF-a含量。建立標準曲線,設(shè)標準孔8孔,每孔中加入樣品稀釋液100mL,混勻后用加樣器吸出100mL,移至第2孔。如此反復(fù)對倍稀釋至第7孔,最后,從第7孔中吸出100mL棄去,使之體積均為100mL。第8孔為空白對照。加樣,待測品孔每孔也各加待測樣品100mL。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120 min。

洗板,用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次,濾紙上印干。每孔中加入第一抗體液50mL。將反應(yīng)板置37℃60 min。

洗板(同前)。每孔加酶標抗體工作液100mL。將反應(yīng)板置37℃60 min。

洗板(同前)。將每孔加入底物工作液100mL,置37℃暗處反應(yīng)5～10 min。在492 nm處測吸光值。

1.6.3 結(jié)果計算與判斷

2 結(jié)果

2.1 各組半暗區(qū)皮層腦組織TNF-a含量比較

表1 各組半暗區(qū)皮層腦組織TNF-a含量比較(ABC-ELISA法) (±s,pg/mL/g)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

缺血半暗帶區(qū)皮層腦組織中TNF-a含量,各時間點模型組、眼針組與假手術(shù)組比較含量有所升高,經(jīng)統(tǒng)計學處理差異有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。眼針組與模型組比較,3 h時間點經(jīng)比較差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05);24 h時間點有非常顯著性差異(＜0.01),72 h有顯著性差異(＜0.05)。模型組3 h時間點,24 h時間點,72 h時間點含量比較,3 h時間點開始增高,24 h時間點最高,72 h有所下降。詳見表1。

2.2 各組腦缺血再灌注血液TNF-a含量比較

表2 各組腦缺血再灌注血液TNF-a含量比較(ABC-ELISA法) (±s,pg/mL)

注:與假手術(shù)組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.05,3)＜0.01

血液中TNF-a含量與腦組織中的含量趨勢基本相同,眼針組與模型組比較, 3 h時間點經(jīng)統(tǒng)計學處理(＜0.05),有顯著性差異;24 h時間點有非常顯著性差異(＜0.01);72 h有顯著性差異(＜0.05)。詳見表2。

3 討論

近年來的研究表明,腦缺血再灌注損傷的機制之一,即過度的炎癥反應(yīng),TNF-a是主要的致炎因子[3,4]。腦缺血再灌注后,TNF-a在腦缺血再灌注后表達增加[5]。TNF-a和其他相關(guān)因子的表達在缺血再灌注后引起的炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等組織損傷中起著重要的作用。TNF-a的釋放可激活多形核白細胞(PMN),增加白細胞-內(nèi)皮細胞粘附分子的表達,促進白細胞粘附于毛細血管或小血管壁,逐漸滲透至腦組織?；罨腜MN可釋放多種炎癥介質(zhì)、氧自由基,在腦缺血再灌注后的組織損傷中起重要作用。再者,TNF-a尚可激活腦內(nèi)的巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生炎性代謝產(chǎn)物[6-8]。保持炎性反應(yīng),進一步促進活化細胞進入缺血區(qū)及周邊部位,產(chǎn)生再次或長期損傷,并影響半暗帶的恢復(fù)。另一方面,TNF-a還可促進IL-1、IL-6及粒細胞-單核細胞集落因子的釋放,協(xié)同炎性作用。TNF的受體是TNFRI,TNFRI與TNFRI相關(guān)死亡區(qū)蛋白(TNFR1- associated protein with death domain,TRADD)形成同源性聯(lián)結(jié),而TRADD再通過其死亡區(qū)與FADD的死亡區(qū)結(jié)合,進而形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體,激活caspase-8,啟動caspases級聯(lián)反應(yīng),最終激活caspase-3,導(dǎo)致細胞凋亡[9]。

眼針療法是彭靜山教授首創(chuàng)的一種微針療法。理論依據(jù)為眼與腦、臟腑、經(jīng)絡(luò)的聯(lián)系的論述,定穴方法根據(jù)眼部八廓配八卦、臟腑的關(guān)系確立了眼周八區(qū)十三穴。根據(jù)眼針的取穴原則,針對中風的疾病基礎(chǔ)是肝腎陰虛,取肝區(qū)、腎區(qū)滋補肝腎,上肢屬上焦,下肢屬下焦,因此取上焦區(qū)、下焦區(qū)通經(jīng)活絡(luò),疏通上下肢經(jīng)脈氣血,使肢體經(jīng)絡(luò)氣血通暢,經(jīng)脈得養(yǎng),半身不遂得以恢復(fù)。本研究從眼針對缺血再灌注后與炎癥和凋亡相關(guān)的腫瘤壞死因子(TNF-a)含量變化,探討眼針治療中風的可能機理。

我們的實驗結(jié)果顯示,模型組缺血半暗區(qū)皮層腦組織中TNF-a含量,與假手術(shù)組比較各時間點均升高,經(jīng)統(tǒng)計學處理差異非常顯著。說明缺血再灌注損傷時缺血半暗區(qū)皮層腦組織中TNF-a含量升高。眼針組與模型組比較,3 h時間點差異不顯著;24 h時間點差異非常顯著;72 h差異顯著。模型組3 h時間點,24 h時間點,72 h時間點含量比較,3 h時間點開始增高,24 h時間點最高,72 h有所下降。血液中TNF-a含量與腦組織中的含量趨勢基本相同。我們推測,腦缺血能快速誘導(dǎo)TNF-a的表達增加,導(dǎo)致缺血腦組織中TNF-a含量升高,其來源可能主要為缺血側(cè)神經(jīng)元,神經(jīng)元合成分泌大量TNF-a,進入外周血,進一步導(dǎo)致血清中TNF-a含量亦明顯升高。腦缺血后機體處于應(yīng)激狀態(tài),細胞因子網(wǎng)絡(luò)被快速激活,除神經(jīng)元外機體其他組織器官可能也合成分泌TNF-a進入外周血,形成累積效應(yīng),造成血清中TNF-a升高。

研究結(jié)果表明,眼針可降低缺血半暗區(qū)皮層腦組織及血液中TNF-a含量,從而抑制缺血再灌注的炎癥反應(yīng)及細胞凋亡,對缺血再灌注的腦損傷起保護作用。

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Effect of Eye Acupuncture on the Tumor Necrosis Factor Contents of Brain Tissue and Blood in Rats with Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion Injury

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,,110032,

To explore a possible mechanism for eye acupuncture treatment of ischemic cerebrovascular disease.Rats were randomly allocated to sham operation, model and eye acupuncture groups. A rat model of focal cerebral ischemia and reperfusion injury was made by the modified MCA thread-occlusion method. Ear points Shangjiao, Xiajiao, liver and kidney were selected for acupuncture. Rat brain and blood TNF-acontents were measured by ELISA.There was a statistically significant difference between the eye acupuncture and model groups (＜0.01).Eye acupuncture can decrease the TNF-acontents of cerebral ischemic penumbrazone and blood. This may be one of the mechanisms of eye acupuncture treatment for ischemic cerebrovascular disease.

Acupuncture; Eye acupuncture; Cerebral ischemia; Tumor necrosis factor; Rat

R2-03

A

1005-0957(2011)02-0071-03

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.02.071

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2007CB512702)

王鵬琴(1962 - ),女,主任醫(yī)師,博士,碩士生導(dǎo)師

2010-10-20