李劍敏 周國興 宋海鵬 何志軍 張斌

熊果酸(ursolic acid，UA)又名烏索酸、烏蘇酸，是廣泛存在于蘆筍、白花蛇舌草、女貞子、烏梅等天然植物和草藥中的五環(huán)三萜類化合物，具有抗癌、抗炎、護肝、降血脂、降糖、抗氧化和抗病毒等多種生物學活性。近來研究表明，抗腫瘤活性是熊果酸最主要的藥理作用，抗腫瘤作用具有多方面和全方位等特點［1］。研究證明，熊果酸對肺癌細胞 A-549、胃癌SGC7901、白血病細胞P-388、L-1210和THP-1等均具有細胞毒性作用［2］，但其作用機制一直未明確。本實驗擬用熊果酸干預處理人急性早幼粒白血病HL60細胞，體外培養(yǎng)實驗，進一步研究其對HL60細胞的增殖抑制、誘導凋亡作用及機制。

1 資料與方法

1.1 材料 急性早幼粒白血病HL60細胞由南華大學藥物藥理研究所惠贈。UA為Sigma公司產品，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，配制成1 mmol/L的濃縮液，凍存于-20℃，臨用前用培養(yǎng)基稀釋并調整DMSO終濃度為0.06%。四甲基偶氮唑藍［MTT］為Amresco公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HL60細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 增殖抑制實驗 HL60細胞以2×104/孔接種于96孔板，用 0、10、20、40 、80 μmol/L UA 分別處理 24、48、72 h 后，加入5 g/L MTT作用4 h。4℃離心，棄上清，加入DMSO振蕩溶解后，用熒光酶標儀于570 nm波長下讀取吸光度值，以0 μmol/L UA組為對照組，計算增殖抑制率，增殖抑制率=［(對照組吸光度值-實驗組吸光度值)/對照組吸光度值］×100%。

1.2.3 熒光顯微鏡細胞形態(tài)學觀察 HL60細胞經0、20、40、80 μmol/L UA 分別作用24 h后，800 g/min離心5 min，收集細胞，PBS洗滌，調整細胞數至2×105個/ml，吹打均勻，取25 μl懸液加到載玻片上，加5 μl吖啶橙染色后置熒光顯微鏡(波長250～350 nm)觀察細胞形態(tài)。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期相分布及細胞凋亡率 取對數生長期 HL60細胞用0、20、40 、80 μmol/L UA 分別作用24 h，800 g/min離心5 min，收集5×106個細胞，預冷 PBS洗滌一次，加入70%預冷乙醇，4℃固定過夜。離心棄乙醇，PBS洗滌一次后加入RNA酶(1 mg/ml)200 μl，37℃水浴30 min后，加入 500 μl PI(50 mg/L)，4℃避光染色30 min，流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，以均數±標準差()表示，采用t檢驗P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制試驗 MTT檢測顯示10～80 μmol/L UA對HL60細胞具有一定增殖抑制效果，且呈較明顯的濃度和時間依賴性(見圖1)，10、20 μmol/L UA對HL60細胞的作用微弱，40、80 μmol/L UA作用24 h后，HL60細胞呈現明顯的增殖抑制。

圖1 UA對HL60細胞的增殖抑制作用

2.2 細胞生長抑制的形態(tài)學變化 AO染色后，熒光顯微鏡下觀察，未用藥的細胞生長良好，80 μmol/L UA作用24 h的HL60細胞可看到典型的細胞凋亡形態(tài)學變化(圖2):細胞染色質濃縮，聚集于核邊緣形成塊狀或新月狀;細胞體積縮小，核固縮深染，部分裂解形成凋亡小體。

2.3 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡率 UA作用24 h后，與對照組(0 μmol/L) 相比，40 μmol/L 、80 μmol/L UA 可使G0/G1期細胞增多，出現G0/G1期阻滯，S期和G2/M期細胞數減少，凋亡細胞峰(Sub-G1)及凋亡率逐漸增高，凋亡率與對照組相比均差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3)。

圖2 熒光顯微鏡觀察UA作用24 h后HL60細胞的形態(tài)改變

圖3 流式細胞儀檢測不同濃度UA作用24 h后HL60細胞的凋亡率

3 討論

熊果酸屬于α-香樹脂醇(α-amyrin)型五環(huán)三萜類化合物，存在于許多植物中，具有廣泛的生物學活性，不僅對多種致癌、促癌物有抵抗作用，而且對多種惡性腫瘤細胞有明顯細胞毒作用和誘導分化作用。樊明文等［3］研究表明，熊果酸通過抑制舌鱗癌細胞株TsCCa的增殖來發(fā)揮抗腫瘤作用;趙曉燕等［4］報道，熊果酸對胃癌BGC823細胞具有增殖抑制及誘導凋亡作用;Cha HJ等［5］對侵襲性最強的HT1080纖維瘤細胞進行研究，發(fā)現熊果酸可以通過胞漿內糖皮質激素受體的移位下調人纖維肉瘤HT-1080細胞基質金屬酶-9(MMP-9)基因的表達，從而降低纖維瘤的侵襲性。這些研究在一定程度上揭示了熊果酸的抗腫瘤效應，但具體的抗瘤機制一直未得到明確。

本次研究以人急性早幼粒白血病HL60細胞為研究對象進行體外培養(yǎng)，熊果酸干預處理，細胞增殖抑制實驗(MTT)表明:10～80 μmol/L UA對HL60細胞具有一定增殖抑制效果，且呈濃度和時間依賴性。10、20 μmol/L UA對HL60細胞的作用微弱，40 μmol/L起開始具有較明顯的作用。80 μmol/L UA作用24 h的HL60細胞AO染色后熒光顯微鏡下可看到典型的細胞凋亡形態(tài)學變化:細胞染色質濃縮，聚集于核邊緣形成塊狀或新月狀;細胞體積縮小，核固縮深染，部分裂解形成凋亡小體。UA處理24 h后，流式細胞檢測結果顯示G0/G1期細胞增多，出現G0/G1期阻滯，S期和G2/M期細胞數減少，凋亡細胞峰(Sub-G1)及凋亡率逐漸增高，說明熊果酸體外可誘導HL60細胞發(fā)生凋亡來產生抗腫瘤活性。熊果酸誘導腫瘤細胞凋亡的具體途徑可能是干擾了細胞信號通路中的某些環(huán)節(jié)有關，有待進一步開展更深層次的研究。

［1］夏國豪.熊果酸抗腫瘤作用研究進展國外醫(yī)學.腫瘤學分冊，2002，29(6):420-422.

［2］Lee KH，Lin YM，Wu TS，et al.The cytotoxic principles of Prunella vulgaris，Psychotria serpens and Hyptis capitata:Ursolic acid related derivatices.Planta Med，1998，54:308-311.

［3］樊明文，王茜，邊專，等.熊果酸對人舌鱗癌細胞株TSCCa的抑制作用及其機制探討武漢大學學報(醫(yī)學版)，2004，25(1):1-3.

［4］趙曉燕，胡玉娜，康向東，等.熊果酸誘導人胃癌BGC823細胞凋亡及其作用機制初探中國癌癥雜志，2010，20(2):101-104.

［5］Cha HJ，Bae SK，Lee HY，et al.Anti invasive activity of ursolic acid correlateswith the reduced exp ression ofmatrixmet allop rotein2 ase-9(MMP-9)in HT1080 human fibrosarcoma cells.Cancer Res，1996，56(10):2281-2284.