張茂華，劉曉妮，李志軍

（1.山西省畜牧遺傳育種中心，太原 030027；2.山西省生態(tài)畜牧產(chǎn)業(yè)管理站，太原 030001；山西農(nóng)業(yè)大學動科院）

家畜精液保存技術(shù)是一項先進的動物繁殖技術(shù)，它是隨著人工授精技術(shù)的廣泛運用而產(chǎn)生的，是人工授精技術(shù)的重大革新。在溫度變化過程中，精清對精子的保護能力是有限的，為了延長精子在體外的存活時間和受精力，便于保存和運輸，常向精液中加入適宜精子存活的稀釋液。稀釋液是精子的保護劑，其成分和含量必須符合精子的生物學特性和低溫保護性能。本試驗選擇一種國外稀釋液和我國普遍應用的稀釋液進行比較，以評定不同稀釋液對牛冷凍精液品質(zhì)的影響，對牛冷凍精液新型稀釋液的開發(fā)和牛冷凍精液品質(zhì)的提高具有一定的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 進口稀釋液：某國進口稀釋液，200mL/瓶。自配稀釋液：果糖，三羥甲基氨基甲烷（Tris），甘油，檸檬酸，卵黃（新鮮雞蛋中?。?，青霉素，鏈霉素，雙蒸餾水。

1.1.2 儀器 法國卡蘇公司進口的細管精液設(shè)備，冰箱，電子天平，電熱恒溫干燥箱，電熱恒溫水浴鍋，普通顯微鏡，移液器，血細胞計數(shù)板，計數(shù)器，離心機，液氮罐，牛用采精器械，電子恒溫板。

1.1.3 稀釋液的配置 稀釋液Ⅰ（國產(chǎn)稀釋液）：第1液，雙蒸水73mL、三羥甲基氨基甲烷2.42 g、檸檬酸1.34 g、果糖1 g、甘油7mL，混合熱溶滅菌30 min；第2液，取第1液80mL，加入新鮮卵黃20mL、青霉素16萬u、鏈霉素10萬u。

稀釋液Ⅱ（進口稀釋液）：取進口稀釋液20mL，加入雙蒸水80mL，混合均勻。

1.2 方法

1.2.1 采精與精子質(zhì)量評定 2010年在山西省家畜凍精中心選取10頭體格健康、性欲旺盛、采過精液的種公牛，其中包括5頭荷斯坦公牛和5頭夏洛萊公牛。實驗室鏡檢鮮精活率、活率、密度和畸形率；鮮精質(zhì)量要求：精子濃度大于6億/mL，活率大于0.7，畸形率小于10%。合格精液方可用于冷凍。

1.2.2 精液稀釋 將每份合格精液立即將其平均分成2等份，放在2個大試管中，分別用2種稀釋液按相同的稀釋倍數(shù)進行稀釋。

用稀釋液Ⅰ和Ⅱ稀釋的精液，放在4℃低溫柜中平衡4 h。

1.2.3 精液的分裝和冷凍 平衡后的稀釋精液，用分裝機吸入有標識（如牛號等）的塑料細管內(nèi)并封口。把參試牛的細管均勻擺放到同一金屬架上，以保證冷凍環(huán)境的一致，每架擺放175支細管。擺有細管的金屬架放入冷凍箱中冷凍，當細管的溫度降到-140℃時，把細管浸入液氮中待用。

1.2.4 精液的解凍 每頭牛每種稀釋液的細管精液取3支，浸泡到39℃的溫水中解凍，待精液完全融化時馬上從溫水中拿出，擦干水跡待檢。

1.2.5 精子質(zhì)量檢測

1）精子活率檢查：3支細管分別直接置于39℃水浴中解凍，取解凍3支混合后精液約50 μL置于載玻片上加蓋玻片，立即在載物臺保持38℃的情況下用200～400倍顯微鏡觀察活率，也可通過電視顯微裝置在熒光屏上觀察活率。每樣片觀察3個視野，并應觀察不同液層內(nèi)的精子運動狀態(tài)，進行全面評定。

3）畸形率（包括頂體完整率）的測定：姬姆薩染色法：①抹片：取1～2滴精液滴于載片一端，用另一邊緣光滑的玻片與有樣品的玻片呈35度，將樣品均勻涂抹于載玻片上，自然風干（約15 min）。②固定：在風干抹片上滴1～2mL中性福爾馬林固定液，固定15 min后用清水緩緩沖去固定液，吹干或自然干燥。③染色：將干燥的固定后的抹片反扣在帶有平槽的有機玻璃板面上，把姬姆薩染色液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸染液，染色1.5 h后用清水緩緩沖去染液，晾干待檢。④鏡檢：將制備好的抹片在400倍顯微鏡下觀察精子畸形率；而頂體完整率是在抹片上滴一滴香柏油，置于400倍顯微鏡下觀察。⑤每樣品制作兩個抹片，每抹片觀察300個精子以上（分左右兩個區(qū)），取兩片的平均值，兩片的變異系數(shù)不得超過20.0%。

1.2.6 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種稀釋液對荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后活率的影響 給定顯著性水平α=0.05，由t值表查得t0.05（8）=2.306。由表 1 可知，對兩種稀釋液稀釋 HS（荷斯坦牛）牛精液解凍后的成活率進行t檢驗，|t|=0.307＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理HS牛精液解凍后的成活率差異不顯著（P＞0.05）；對兩種稀釋液稀釋XL（夏洛萊肉牛）精液解凍后的成活率進行t檢驗，|t|=0.069＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理XL牛精液解凍后的成活率差異不顯著（P＞0.05）。

表1 兩種稀釋液對荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后活率的影響%

2.2 兩種稀釋液對荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后畸形率的影響 給定顯著性水平α=0.05，由t值表查得 t0.05（8）=2.306。由表 2可知，對兩種稀釋液稀釋 HS牛精液解凍后畸形率進行t檢驗，|t|=0.223＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理HS牛精液解凍后畸形率差異不顯著（P＞0.05）；對兩種稀釋液稀釋XL牛精液解凍后畸形率進行t檢驗，|t|=0.039＜2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理XL牛精液解凍畸形率差異不顯著（P＞0.05）。

表2 兩種稀釋液對荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后畸形率的影響%

2.3 兩種稀釋液對荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后頂體完整率的影響 給定顯著性水平α=0.05，由t值表查得t0.05（8）=2.306。由表3可知，對兩種稀釋液稀釋HS牛精液解凍后頂體完整率進行t檢驗，|t|=2.368＞2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理HS牛精液解凍后頂體完整率差異顯著；對兩種稀釋液稀釋XL牛精液解凍后頂體完整率進行t檢驗，|t|=3.150＞2.306，表明所采用的兩種稀釋液處理XL牛精液解凍后頂體完整率差異顯著（P＜0.05）。

表3 兩種稀釋液對荷斯坦奶牛和夏洛萊肉牛精液解凍后頂體完整率的影響%

3 討論與分析

卵黃因含有卵磷脂，能穩(wěn)定精子細胞膜，防止頂體破裂；其融點低，在低溫下不易被凍結(jié)，加入精液后可透入精子內(nèi)代替縮醛磷脂而被利用，故可保護精子防止冷休克的發(fā)生。Moussa等［1］認為，卵黃中的低密度脂蛋白（LDL）在精子冷凍過程中可抵御低溫打擊，提高精子活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整性。目前，對卵黃的研究還在繼續(xù)，Andrabi等［2］試驗證實，添加鴨卵黃冷凍水牛精液效果明顯好于其它禽類卵黃。

但是，卵黃應用于稀釋液中存在一定的弊端：卵黃內(nèi)可能存在著病原菌，會在稀釋液的攜帶下傳播，影響動物冷凍精液在國際和國內(nèi)的種質(zhì)交流；此外，在有氧條件下，卵黃中的某些氨基酸在酶作用下，可能產(chǎn)生對精子有害的過氧化氫?？紤]到這些不利因素，國外一些國家在稀釋液中已經(jīng)不使用卵黃、牛奶這類動物源性添加物，正流行著用大豆卵磷脂取代卵黃，以避免卵黃中病原體的傳播。Leeuw等［3］和Thun等［4］分別用大豆提取物的稀釋液處理牛精液，效果都不理想，不返情率顯著低于對照組。Moussaa等［1］、胡建宏等［5］均報道利用 LDL代替卵黃在牛和豬上冷凍精液效果比商業(yè)用的稀釋液好。

從試驗結(jié)果來看，稀釋液Ⅰ和稀釋液Ⅱ?qū)δ膛：腿馀＠鋬鼍旱幕盥屎突温视绊懖淮?，但是使用稀釋液Ⅰ稀釋的奶牛和肉牛精液的頂體完整率顯著高于使用稀釋液Ⅱ稀釋的奶牛和肉牛精液的頂體完整率。

進口稀釋液無卵黃不含動物源成分，稀釋后的精液細菌數(shù)少，降低了精液的污染風險，使用簡單，用蒸餾水稀釋即可使用。但購買成本昂貴。保存周期長。極易因保存條件變化而影響使用效果。而國產(chǎn)稀釋液取材簡單，可以隨配隨用，而且成本相比較低。雖操作略繁瑣一些，但頂體完整率略占優(yōu)勢，有好的受胎率，也是一種很好的稀釋液配方。對未來開發(fā)新的稀釋液配方有一定的指導意義。

［1］MoussaM，MartinetV，Trimeche，etal.Low densitylipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method：cryoprotective effect on frozen-thawed bullsemen［J］.Theriogenology，2002，57（6）：1695-1706.

［2］Andrabi S M，Ansari M S，Ullah N，et al.Duck egg yolk in extender improves the freezability of buffalo bull spermatozoa［J］.Animal Reproduction Seience，2008，104（2）：427-433.

［3］Leeuw，Haring，Kaal-Lansbergen，et al.Fertility results using bovine semen cryopreserved with extenders based on egg yolk and soy bean extract［J］.Theriogenology，2000，54（4）：57-67.

［4］Thun，Maria Hurtado，Janett，et al.Comparison of Biociphos-Plus and TRIS-egg yolk extender for cryopreservation of bull semen［J］.Theriogenology，2002，57（3）：1087-1094.

［5］Jian-hong Hu，Qing-wang Li，Gang Li.The cryoprotective effect on frozen-thawed boar semen of egg yolk low density lipoproteins［J］.Asian-Aust J Anim Sci，2006，19（4）：486-494.